當(dāng)歸芍藥散對(duì)老年大鼠松果體功能的影響及對(duì)神經(jīng)元Aβ?lián)p傷的保護(hù).pdf

1、當(dāng)歸芍藥散(DSS)是出自《金匱要略》的婦科名方，有養(yǎng)血活血、健脾化濕利水之功能。上世紀(jì)80年代末有人用于治療老年性癡呆取得療效。研究表明，DSS可改善老年性學(xué)習(xí)、記憶功能低下鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，改善老年小鼠平衡和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)功能；提高老年機(jī)體抗自由基損害能力；促進(jìn)衰老時(shí)中樞膽堿能神經(jīng)功能低下的恢復(fù)，被認(rèn)為是一個(gè)理想的光譜抗衰老中藥方劑。隨著年齡的老化，松果體功能逐漸減退，褪黑素分泌逐漸減少，并失去晝夜節(jié)律，導(dǎo)致生物鐘失調(diào)是造成衰老的一個(gè)

2、重要因素。應(yīng)用褪黑素防治神經(jīng)元退行性病變的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)之一，其在抗氧化，線粒體保護(hù)，抗Aβ沉淀，抗凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等方面取得了一定的進(jìn)展。而以往的研究表明：當(dāng)歸芍藥散和褪黑激素均有改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗氧化、清除自由基、抗衰老及治療老年性癡呆的作用。因此二者間是否有著某種聯(lián)系，即當(dāng)歸芍藥散是否可以通過(guò)促進(jìn)褪黑激素分泌從而發(fā)揮其一系列作用?有研究表明在不同年齡段的Tg2576轉(zhuǎn)基因AD模型鼠中應(yīng)用褪黑素治療，其療效差異很大，在老年轉(zhuǎn)

3、基因鼠中，褪黑素的抗Aβ和抗氧化效果不明顯。當(dāng)歸芍藥散抗衰老作用是否也存在與褪黑素類似的療效差異，當(dāng)歸芍藥散與褪黑素對(duì)衰老的預(yù)防和治療效果是否相同? 基于以上問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)首先用當(dāng)歸芍藥散湯劑灌服老年大鼠21天，探討其對(duì)老年鼠松果體功能有無(wú)改善，能否促進(jìn)褪黑素分泌。在體外實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Aβ25-35作用于不同衰老程度的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，觀察當(dāng)歸芍藥散和褪黑素的療效差異。為當(dāng)歸芍藥散和褪黑素應(yīng)用與臨床抗衰老和治療老年性癡呆提供理論依

4、據(jù)。 材料和方法: 一、當(dāng)歸芍藥散對(duì)老年大鼠松果體功能的影響1中藥制備當(dāng)歸芍藥散一共包含六味中藥，中藥湯劑煎法如下：中藥按比例混合后，加8倍體積的蒸餾水浸泡1h，然后煎2h，收集藥水；再往藥渣中加6倍體積蒸餾水，煎1.5h，收集藥水；將兩次收集的藥水混合后濃縮成1g生藥/ml，放4℃冰箱備用，用時(shí)加熱至溫?zé)帷?2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和用藥血清褪黑素測(cè)定采用20月齡的老年SD大鼠分成灌藥組和老年對(duì)照組，再加上一組三月齡SD

5、大鼠作為青年對(duì)照組。其他各實(shí)驗(yàn)均用20月齡的老年SD大鼠分為灌藥組和對(duì)照組。灌藥組于晚上11點(diǎn)在微弱紅光下灌服DSS3ml，連續(xù)用藥21天，對(duì)照組在同樣條件下灌服同體積的蒸餾水。 3取材 (1)采血：灌藥第21天上午10:30～11:30于尾靜脈采血0.5ml；當(dāng)天晚上在灌藥半小時(shí)后在紅光下再采血0.5ml。血液采集后經(jīng)離心，取血清0.3～0.6μml，于4℃冰箱保存數(shù)日后移入-20℃冰箱保存。 (2)取松果體：

6、在用藥第21天晚上灌完后間隔半個(gè)小時(shí)，在微弱紅光下快速斷頭處死老鼠，取出松果體。 4血清褪黑素濃度的測(cè)定老年大鼠20只，青年大鼠10只，分組以及取材如前述。取得的血清用褪黑激素放免測(cè)定試劑合測(cè)定褪黑素濃度。 5松果體β-AR、P-CREB與T-CREB、AA-NATmRNA測(cè)定松果體β-AR測(cè)定需要老年SD大鼠30只，其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)需要老年SD大鼠20只，分組及取材如前述。松果體β-AR測(cè)定三個(gè)松果體為一個(gè)樣本，其他兩個(gè)實(shí)

7、驗(yàn)兩個(gè)松果體為一個(gè)樣本。取得松果體樣本放-70℃保存。分別用[3H]DHA測(cè)定松果體β-AR的含量，用western-blot測(cè)定總CREB和磷酸化CREB，用real-timeRT-PCR測(cè)定AA-NATmRNA的表達(dá)。 二、當(dāng)歸芍藥散對(duì)神經(jīng)元Aβ?lián)p傷的保護(hù) 1藥物血清的采集老年SD大鼠10只平均分成兩組，分別灌服當(dāng)歸芍藥散和純凈水(用藥時(shí)間和藥量同前面實(shí)驗(yàn))21天后，在紅光下快速處死老鼠，從心臟取血，然后離心(750

8、g)10min，取血清，將血清放入56℃水浴30min，過(guò)濾除菌后分別制成了藥物血清和空白血清，置-20℃冰箱備用。 2海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)和分組本課題組已經(jīng)成功建立了海馬神經(jīng)元體外模擬衰老模型。 培養(yǎng)10天和25天神經(jīng)元分別分成5組：A對(duì)照組；BAβ25-35組；CAβ25-35+melatonin組；DAβ25-35+空白血清組；EAβ25-35+藥物血清組。細(xì)胞在培養(yǎng)10天或25天后，B、C、D、E組各加入20μM的A

9、β25-35，C、D、E分別加入10μM的褪黑素、5％的空白血清和5％的藥物血清，每孔體積100μL。 3當(dāng)歸芍藥散對(duì)Aβ25-35所致神經(jīng)元氧化應(yīng)激、線粒體膜電位損傷及PGC-1α表達(dá)影響的檢測(cè)培養(yǎng)10天和25天神經(jīng)元均給予20μM的Aβ25-35刺激，同時(shí)分別應(yīng)用5％的藥物血清和10μM的褪黑素干預(yù)24h后，用熒光探針DCFH-DA(20μM)或熒光染料羅丹明123孵育，在微孔板熒光酶標(biāo)儀分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量和線粒體膜

10、電位值的變化；應(yīng)用谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒(比色法)測(cè)定細(xì)胞勻漿中GSH含量。利用Westernblot檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞PGC-1α蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果: 一、當(dāng)歸芍藥散對(duì)老年大鼠松果體功能的影響1老年大鼠夜間血清褪黑素濃度(11.395±0.532)較青年大鼠(39.696±2.631)明顯降低(P<0.01)，而白天濃度無(wú)顯著性差異。 2灌藥組老年大鼠與對(duì)照組老年大鼠白天血清中褪黑素濃度也無(wú)顯著性差異，但

11、灌藥三周后老年大鼠晚上血清中褪黑素的濃度(27.239±1.906)比對(duì)照老年大鼠(11.395±0.532)明顯增高(P<0.01)，尚未達(dá)到青年大鼠水平(39.696±2.631)。 3灌服DSS的老年大鼠松果體夜間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)：[3H]-DHA的特異性結(jié)合明顯升高(P<0.035)；NATmRNA的表達(dá)明顯升高(p<0.05)；CREB的磷酸化增強(qiáng)(P<0.05)，但總CREB的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生變化。 二、當(dāng)歸芍藥散對(duì)

12、海馬神經(jīng)元Ap25-35損傷的保護(hù)1Aβ25-35刺激使神經(jīng)細(xì)胞氧自由基顯著增高、GSH減少、線粒體膜電位降低和PGC-1α表達(dá)減少(P<0.01)。 2當(dāng)歸芍藥散不管對(duì)培養(yǎng)10d還是25d的海馬神經(jīng)元，對(duì)于氧自由基的增高和GSH減少都有明顯的改善作用(P<0.01)，并都可以改善線粒體膜電位(P<0.01)和促進(jìn)PGC-1蛋白的表達(dá)(P<0.05)。 3對(duì)于氧自由基的增高和GSH減少，培養(yǎng)10d和25d后應(yīng)用褪黑素，都

13、有明顯的改善作用(P<0.05)；而線粒體膜電位的改善和PGC-1蛋白的表達(dá)方面，褪黑素只對(duì)培養(yǎng)10d的神經(jīng)元有作用(P<0.05)，對(duì)培養(yǎng)25d的神經(jīng)元改善作用不明顯(P>0.05)。 結(jié)論: 一、當(dāng)歸芍藥散改善老年大鼠的松果體功能1DSS可以提高老年大鼠夜間血清褪黑素濃度，并恢復(fù)其晝夜節(jié)律。 2DSS使松果體內(nèi)褪黑素分泌所需要的cAMP依賴性信號(hào)通道明顯增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)松果體β-AR、NATmRNA

14、的表達(dá)，并促進(jìn)CREB的磷酸化。 二、當(dāng)歸芍藥散與褪黑素對(duì)不同衰老程度神經(jīng)元Aβ25-35損傷的保護(hù)效果有差異。 1當(dāng)歸芍藥散與褪黑素能改善Aβ25-35引起的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基升高和GSH值降低，對(duì)不同衰老程度的神經(jīng)元均有保護(hù)效果； 2當(dāng)歸芍藥散能改善不同衰老程度神經(jīng)元Aβ25-35引起的線粒體膜電位降低，而褪黑素對(duì)衰老神經(jīng)細(xì)胞作用不明顯； 3Aβ25-35能降低神經(jīng)細(xì)胞PGC-1α的表達(dá)，當(dāng)歸芍藥散能