柑橘轉(zhuǎn)錄因子CsCBF1和PtrNAC72在調(diào)控精氨酸脫羧酶基因表達(dá)及抗逆中的功能鑒定.pdf

1、柑橘是世界上栽培最廣、產(chǎn)量最高的水果作物，其中甜橙所占的比例最大，年產(chǎn)量約為柑橘類水果總產(chǎn)量的60％。甜橙喜溫不耐寒，因此低溫是限制柑橘產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一。多胺是含有兩個或兩個以上氨基的脂肪族化合物，參與植物生長發(fā)育、組織分化、果實成熟與衰老以及抵抗生物和非生物脅迫等重要生理過程，在一定程度內(nèi)，多胺在細(xì)胞中的積累量越多，其脅迫抗性越強(qiáng)。而在逆境脅迫下多胺合成酶基因表達(dá)量的上調(diào)是多胺在細(xì)胞中積累的前提，因此，研究多胺在低溫下的調(diào)控機(jī)理

2、和抗性機(jī)制對于增強(qiáng)甜橙抗性具有十分重要的作用。而在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是高等植物基因表達(dá)的重要調(diào)控途徑，因此分析多胺合成酶基因脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，鑒定多胺合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能在植株抗逆遺傳改良上起到至關(guān)重要的作用。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.甜橙多胺合成酶基因的鑒定及表達(dá)分析。
　　在甜橙中共鑒定出了10個多胺合成酶基因，分別為精氨酸脫羧酶(ADC)，亞精胺合成酶（SPDS1，SPDS2），精胺合成酶(SPMS)，S-腺苷甲硫

3、氨酸脫羧酶（SAMDC1，SAMDC2，SAMDC3，SAMDC4），熱精胺合成酶(ACL5-1，ACL5-2)。它們分布在甜橙的6條染色體上。上述基因在根中表達(dá)量較高，在果皮和果實上表達(dá)量較低。在腐胺處理下，大多數(shù)多胺合成酶基因呈下調(diào)趨勢;在亞精胺處理下，ADC，SPDS2，SAMDC4呈上調(diào)趨勢，其余基因表達(dá)量下調(diào);在精胺處理下則相反。在不同組織中和不同脅迫處理下多胺合成酶基因表達(dá)模式差別較大，SPDS1，SAMDC3和SAMDC4

4、響應(yīng)低溫脅迫，SAMDC2，ACL5-2受脫落酸(ABA)處理的誘導(dǎo)，其余基因受高鹽脅迫的誘導(dǎo)。而在葉片中，主要是ADC和SAMDC4響應(yīng)低溫脅迫。低溫下不同甜橙組織多胺的變化模式也不同。甜橙葉片中腐胺上升最為明顯，而愈傷中精胺上升顯著。脅迫表達(dá)分析和腐胺含量的變化表明ADC是響應(yīng)低溫脅迫的主要基因。
　　2.低溫脅迫下CsCBF1誘導(dǎo)ADC基因表達(dá)和腐胺合成。
　　CBFs轉(zhuǎn)錄因子在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演了重要作用。低溫脅

5、迫下，CBFs基因全部被誘導(dǎo)表達(dá)，其中CBF2，CBF3誘導(dǎo)倍數(shù)最高;高鹽脅迫下，CBF3表達(dá)量上調(diào);ABA處理后，只有CBF4表達(dá)量沒有明顯變化。在四個CBFs中，CBF1能與ADC啟動子結(jié)合并能夠誘導(dǎo)其表達(dá)。在甜橙和擬南芥CsCBF1超表達(dá)系中，ADC表達(dá)量升高，內(nèi)源腐胺合成增多，低溫抗性增強(qiáng)。實驗結(jié)果表明CsCBF1在ADC基因表達(dá)和腐胺合成中扮演著正向調(diào)控因子的作用。
　　3.干旱脅迫下PtrNAC72抑制ADC基因表達(dá)和

6、腐胺合成。
　　在前期實驗中，以ADC的啟動子為誘餌(bait)，采用酵母單雜交技術(shù)從枳cDNA文庫中篩選出了一個新的轉(zhuǎn)錄因子PtrNAC72。PtrNAC72定位在細(xì)胞核中，其相對不保守的C端具有轉(zhuǎn)錄活性。PtrNAC72能特異性地結(jié)合在ADC啟動子上的CCGAC順式作用元件，而且GUS染色證明PtrNAC72是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子。在擬南芥nac72突變體中腐胺含量顯著升高，恢復(fù)系中和野生型相似，但明顯低于突變體。說明PtrNAC

7、72能夠抑制ADC基因的表達(dá)和腐胺的合成。PtrNAC72煙草超表達(dá)系脫水和干旱脅迫抗性降低，體內(nèi)抗氧化酶活性降低，活性氧積累量升高。而超表達(dá)系在外施腐胺后，恢復(fù)了其內(nèi)源腐胺含量和干旱脅迫的抗性。實驗結(jié)果表明PtrNAC72在ADC基因表達(dá)和腐胺合成中扮演著反向調(diào)控因子的作用。
　　在本研究中，在甜橙數(shù)據(jù)庫中共鑒定了10個不同的多胺合成酶基因，通過表達(dá)量分析及低溫下多胺含量的變化得出精氨酸脫羧酶ADC是響應(yīng)脅迫的主要基因。隨后分別