團(tuán)頭魴MHCⅡα基因的SNP位點(diǎn)開發(fā)、鑒定及與抗病性狀關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）是我們國家在淡水養(yǎng)殖魚類中占有舉足輕重地位的一個優(yōu)良品種，近些年，由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大化，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，集約化養(yǎng)殖程度的大幅度提高，各類疾病頻發(fā)。其中，對團(tuán)頭魴影響最大的就是由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染引起的細(xì)菌性敗血癥，可導(dǎo)致魚體大量死亡。目前，還沒有快速有效的方法對其進(jìn)行預(yù)防和治療。本研究用嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴區(qū)分抗病和易感組，通過PCR擴(kuò)

2、增及測序在MHCⅡα基因上篩選單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（Single nucleotide polymorphisrms, SNP），利用高分辨率溶解曲線法和限制性內(nèi)切酶酶切法對SNP進(jìn)行分型，分析其多態(tài)性及與抗病性狀之間的關(guān)系。
　　在MHCⅡα基因上共篩選出35個候選SNP位點(diǎn)，占MHCⅡα基因總堿基的1.45％，包含30個轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，5個顛換位點(diǎn)。其中外顯子部分有16個，內(nèi)含子部分7個，5'非編碼區(qū)有1個，3'非編碼區(qū)有11個。有13

3、個SNP位點(diǎn)位于編碼區(qū)，占總氨基酸位點(diǎn)的5.56％，位于839 bp的T/A顛換和1663 bp的A/G轉(zhuǎn)換是無義突變，其余11個SNP位點(diǎn)為有義突變。MHCⅡα基因的21個抗原結(jié)合位點(diǎn)(Peptide binding region, PBR)中，有4個位點(diǎn)變異，變異率為19.05％;而non-PBR的變異率僅為8.20％(5/61)。結(jié)果證實團(tuán)頭魴MHCⅡα基因含有豐富的多態(tài)位點(diǎn)、具有極高的特異性且對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了一定影響。

4、α1結(jié)構(gòu)域的SNP位點(diǎn)分別占總堿基和總氨基酸位點(diǎn)的4.88％和10.98％，明顯高于α2結(jié)構(gòu)域的1.08％和3.22％。這是由于α1結(jié)構(gòu)域存在的抗原肽結(jié)合區(qū)具有高度的多態(tài)性，再次證實PBR位點(diǎn)存在于α1結(jié)構(gòu)域。表明抗原結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的多態(tài)性高于非抗原結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性，同時也表明氨基酸的替代、替換集中出現(xiàn)在多肽結(jié)合位點(diǎn)上。NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，團(tuán)頭魴MHCⅡα基因和數(shù)量眾多的硬骨魚類集聚成為一個分支，

5、側(cè)面說明了硬骨魚類應(yīng)該是單系起源的;另外，硬骨魚又一分為二，團(tuán)頭魴和別的鯉科魚類分了一支，鮭鱒魚類為另外一支，二者獨(dú)自進(jìn)化，互不影響。由此可見，團(tuán)頭魴與鯉科魚類中的草魚（Ctenopharyngodon idella）關(guān)系最近，與斑馬魚（Danio rerio）、建鯉（Crprinuscarpio jian）的關(guān)系稍遠(yuǎn)，與大西洋鮭（Salmo salar）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他脊椎動物、哺乳動

6、物的關(guān)系最遠(yuǎn)。
　　對分型成功的5個SNP位點(diǎn)在易感和抗病組中各100尾魚的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計。通過卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)位于1395 bp(T/A)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在易感和抗病組中差異極顯著（P＜0.01），位于221bp(G/T)和1859bp(G/T)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在易感組和抗病組中差異顯著(P＜0.05)。其中位于第三外顯子1395bp(T/A)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔?/p>

7、起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而改變了魚體的抗病性。位于5'非編碼區(qū)221bp（G/T）位點(diǎn)和位于3'非編碼區(qū)1859bp（G/T）位點(diǎn)的突變沒有導(dǎo)致氨基酸改變，但實驗結(jié)果卻顯示與抗病關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明團(tuán)頭魴MHCⅡα基因的多態(tài)性和抗細(xì)菌性敗血癥性狀顯著關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步分析表明，純合個體對嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血病抗性更高。本實驗初步分析獲得的相關(guān)SNP標(biāo)記及相應(yīng)的優(yōu)勢、劣勢基因型，能夠在進(jìn)行團(tuán)頭魴抗病育種工作時為親本的選擇提供理論依