團(tuán)頭魴β-防御素基因的克隆、重組表達(dá)及抗菌作用研究.pdf

1、防御素(Defensin)是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物體內(nèi)、帶正電荷的小分子量抗菌肽。防御素具有廣譜的抑制和殺滅細(xì)菌、真菌、病毒以及腫瘤細(xì)胞等作用，在天然免疫中起重要作用。
　　團(tuán)頭魴（Megalobramaamblycephala）是一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。本研究以團(tuán)頭魴為研究對(duì)象，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆出團(tuán)頭魴β-防御素(β-defensin)cDNA核心序列，對(duì)團(tuán)頭魴β-防御素在組織中的分布情況以及在嗜水氣單胞菌感染后組織中

2、β-防御素表達(dá)水平的變化進(jìn)行了分析，將團(tuán)頭魴β-防御素基因分別構(gòu)建至大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)載體上，進(jìn)行了重組表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了活性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.團(tuán)頭魴β-防御素的克隆及表達(dá)分析
　　獲得的團(tuán)頭魴β-防御素cDNA核心序列為334bp，ORF區(qū)為204bp，在NCBI上blast比對(duì)結(jié)果顯示:團(tuán)頭魴β-防御素cDNA序列與斑馬魚和鯉魚的cDNA序列相似性最高，分別達(dá)到90.2％和86.3％。氨基酸序列中包

3、含防御素典型的6個(gè)半胱氨酸結(jié)構(gòu)。團(tuán)頭魴β-防御素基因廣泛分布于肝臟、脾臟、頭腎等組織中。團(tuán)頭魴在感染嗜水氣單胞菌后，β-防御素基因在肝臟、腸中的表達(dá)量變化不顯著(p＞0.05);在頭腎中，感染后12h和24h團(tuán)頭魴β-防御素基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著的上調(diào);在脾臟中，嗜水氣單胞菌在感染后72h時(shí)，出現(xiàn)極顯著的上調(diào)(p＜0.05)。
　　2.團(tuán)頭魴β-防御素在大腸桿菌中的表達(dá)
　　成功構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-KG-β-defe

4、nsin。在1mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白，重組蛋白經(jīng)分離純化后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示表達(dá)的重組融合蛋白無抑菌活性。將該融合蛋白制備了多克隆抗體，ELISA和western-blot檢測(cè)結(jié)果表明:抗體效價(jià)在1∶3200以上。在肝臟、鰓和心臟組織中用WesternBlot可檢測(cè)到β-防御素。
　　3.團(tuán)頭魴β-防御素在畢赤酵母中的表達(dá)
　　成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-β-defensin。對(duì)陽性菌