團(tuán)頭魴白細(xì)胞介素6的表達(dá)分析及啟動(dòng)子活性的研究.pdf

1、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)屬于鯉科鯉亞科魴屬，草食性，是僅存于我國(guó)的一種重要淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，具有非常好的市場(chǎng)需求。然而，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖密度的擴(kuò)大和環(huán)境污染等因素的影響，各類(lèi)疾病頻繁爆發(fā)。尤其以嗜水氣單胞菌的侵?jǐn)_最為猛烈，引起團(tuán)頭魴大量死亡，使團(tuán)頭魴的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展遭受了巨大的損失。白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子之一，在先天性免疫與獲得性免疫方

2、面皆具有重要作用，已有研究表明其在抵抗病原微生物入侵方面起著重要作用。為了闡明IL-6基因在團(tuán)頭魴抵抗嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中的可能作用，本研究分析了團(tuán)頭魴IL-6基因（MamIL-6）的序列特征，組織分布情況以及細(xì)菌感染后在免疫相關(guān)組織中的表達(dá)情況。此外，構(gòu)建了一系列MamIL-6啟動(dòng)子pGL3重組載體并轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，并用LPS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染過(guò)重組載體的細(xì)胞，分析LPS對(duì)MamIL-6啟動(dòng)子活性的影響，為進(jìn)一步對(duì)IL-6轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的研究奠定了

3、基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.MamIL-6的序列及表達(dá)分析
　　MamIL-6基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1092 bp，其中ORF為699 bp，編碼233個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)80 bp，3'UTR313 bp，3'UTR有9個(gè)不穩(wěn)定的基序。SignaIP等軟件預(yù)測(cè)顯示，MamIL-6基因有一段由24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。多氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，脊椎動(dòng)物IL-6氨基酸序列的同源性很低，然而其蛋白

4、結(jié)構(gòu)與基因結(jié)構(gòu)卻很保守，MamIL-6蛋白有一個(gè)典型的家族信號(hào)(C-X(9)-C-X(6)-G-L-X(2)-Y-X(3)-L）和4個(gè)保守的α螺旋，其基因結(jié)構(gòu)包含5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子。在健康團(tuán)頭魴成魚(yú)11個(gè)組織中，MamIL-6在脾臟中的表達(dá)量最高;嗜水氣單胞菌感染后，MamIL-6的表達(dá)量在被檢測(cè)的免疫相關(guān)組織中均顯著增加，這表明團(tuán)頭魴在進(jìn)行免疫反應(yīng)時(shí)，IL-6基因起舉足輕重的作用。
　　2.MamIL-6候選啟動(dòng)子的生物信息

5、學(xué)分析
　　對(duì)團(tuán)頭魴候選啟動(dòng)子區(qū)域（-1503 bp至+34 bp）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)位于TSS上游21 bp處有一個(gè)TATA BOX，此外，還發(fā)現(xiàn)了許多重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括GRE, USF, CETSI，AP-1，GATA, CRE, STAT, C/EBPβ，NFAT, IRF, SP1，AP-2，NF-κB等。通過(guò)對(duì)不同物種IL-6基因近端啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一些重要的轉(zhuǎn)錄因子比較保守，如GRE，NF-κB

6、，AP-1，GATA等。
　　3.MamIL-6啟動(dòng)子系列缺失體的構(gòu)建及活性分析
　　成功構(gòu)建了5個(gè)不同長(zhǎng)度的重組載體(PGL3-IL-6P)，以PGL3-basic質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，將它們分別與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)鯉EPC細(xì)胞中，24 h后測(cè)定熒光素酶的活性。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照PGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，PGL3-IL-6P-0,PGL3-IL-6P-1,PGL3-IL-6P-2,PGL3-IL-6P-

7、3以及PGL3-IL-6P-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性均明顯升高，其中PGL3-IL-6P-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性最高，說(shuō)明啟動(dòng)子缺失體PGL3-IL-6P-4（-379至+34）包含核心啟動(dòng)子區(qū)。用100ng/mL的LPS刺激轉(zhuǎn)染過(guò)重組載體的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)LPS刺激組相比，僅PGL3-IL-6P-4的活性顯著增加，而其余缺失體的活性則無(wú)明顯變化，這進(jìn)一步說(shuō)明了PGL3-IL-6P-4缺失體確實(shí)包含核心啟動(dòng)子區(qū)，并推測(cè)該區(qū)域存在的