團頭魴白細胞介素6的表達分析及啟動子活性的研究.pdf

1、團頭魴(Megalobrama amblycephala)屬于鯉科鯉亞科魴屬，草食性，是僅存于我國的一種重要淡水養(yǎng)殖魚類，具有非常好的市場需求。然而，近年來隨著養(yǎng)殖密度的擴大和環(huán)境污染等因素的影響，各類疾病頻繁爆發(fā)。尤其以嗜水氣單胞菌的侵擾最為猛烈，引起團頭魴大量死亡，使團頭魴的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展遭受了巨大的損失。白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物學效應的細胞因子之一，在先天性免疫與獲得性免疫方

2、面皆具有重要作用，已有研究表明其在抵抗病原微生物入侵方面起著重要作用。為了闡明IL-6基因在團頭魴抵抗嗜水氣單胞菌感染過程中的可能作用，本研究分析了團頭魴IL-6基因（MamIL-6）的序列特征，組織分布情況以及細菌感染后在免疫相關組織中的表達情況。此外，構建了一系列MamIL-6啟動子pGL3重組載體并轉(zhuǎn)染進細胞，并用LPS誘導轉(zhuǎn)染過重組載體的細胞，分析LPS對MamIL-6啟動子活性的影響，為進一步對IL-6轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理的研究奠定了

3、基礎。
　　主要研究結果如下:
　　1.MamIL-6的序列及表達分析
　　MamIL-6基因的cDNA序列全長為1092 bp，其中ORF為699 bp，編碼233個氨基酸，5'非編碼區(qū)80 bp，3'UTR313 bp，3'UTR有9個不穩(wěn)定的基序。SignaIP等軟件預測顯示，MamIL-6基因有一段由24個氨基酸組成的信號肽。多氨基酸序列比對與系統(tǒng)進化分析表明，脊椎動物IL-6氨基酸序列的同源性很低，然而其蛋白

4、結構與基因結構卻很保守，MamIL-6蛋白有一個典型的家族信號(C-X(9)-C-X(6)-G-L-X(2)-Y-X(3)-L）和4個保守的α螺旋，其基因結構包含5個外顯子與4個內(nèi)含子。在健康團頭魴成魚11個組織中，MamIL-6在脾臟中的表達量最高;嗜水氣單胞菌感染后，MamIL-6的表達量在被檢測的免疫相關組織中均顯著增加，這表明團頭魴在進行免疫反應時，IL-6基因起舉足輕重的作用。
　　2.MamIL-6候選啟動子的生物信息

5、學分析
　　對團頭魴候選啟動子區(qū)域（-1503 bp至+34 bp）進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)位于TSS上游21 bp處有一個TATA BOX，此外，還發(fā)現(xiàn)了許多重要的轉(zhuǎn)錄因子結合位點，包括GRE, USF, CETSI，AP-1，GATA, CRE, STAT, C/EBPβ，NFAT, IRF, SP1，AP-2，NF-κB等。通過對不同物種IL-6基因近端啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)一些重要的轉(zhuǎn)錄因子比較保守，如GRE，NF-κB

6、，AP-1，GATA等。
　　3.MamIL-6啟動子系列缺失體的構建及活性分析
　　成功構建了5個不同長度的重組載體(PGL3-IL-6P)，以PGL3-basic質(zhì)粒作為陰性對照，將它們分別與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進鯉EPC細胞中，24 h后測定熒光素酶的活性。雙熒光素酶檢測結果顯示:與陰性對照PGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，PGL3-IL-6P-0,PGL3-IL-6P-1,PGL3-IL-6P-2,PGL3-IL-6P-

7、3以及PGL3-IL-6P-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性均明顯升高，其中PGL3-IL-6P-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性最高，說明啟動子缺失體PGL3-IL-6P-4（-379至+34）包含核心啟動子區(qū)。用100ng/mL的LPS刺激轉(zhuǎn)染過重組載體的細胞發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)LPS刺激組相比，僅PGL3-IL-6P-4的活性顯著增加，而其余缺失體的活性則無明顯變化，這進一步說明了PGL3-IL-6P-4缺失體確實包含核心啟動子區(qū)，并推測該區(qū)域存在的