團(tuán)頭魴視黃醇結(jié)合蛋白相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）屬于鯉科草食性魚類，分布于長江中下游區(qū)域的附屬中型湖泊中，有生長較快、抗病力強(qiáng)、適溫范圍廣、疾病少、易捕撈、肉肥質(zhì)嫩、營養(yǎng)豐富等諸多優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，近年來國內(nèi)對團(tuán)頭魴進(jìn)化、免疫、抗病力等方面的研究較多。本研究的主要內(nèi)容包括視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein，RBP）及胞內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白(cellularretinol-bindin

2、g protein，CRBP)基因的分子克隆，分析RBP基因在團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織中的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下:
　　1.團(tuán)頭魴血清視黃醇結(jié)合蛋白基因的克隆及序列分析本研究獲得了團(tuán)頭魴rbp4的cDNA全長(815 bp)和基因組DNA全長(4915bp)。采用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:團(tuán)頭魴rbp4基因由五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含予組成，符合GT/AG規(guī)則。其開放閱讀框有579bp，共編碼192個(gè)氨基酸，5'端區(qū)域

3、有34 bp，3'端有202 bp。通過對比不同物種的rbp4基因編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，相比其他物種，團(tuán)頭魴的rbp4編碼的氨基酸序列與鯉(80％)、胡予鯰(93％)、斑馬魚(88％)、虹鱒(82％)、青鳉(70％)、紅鰭東方鲀(71％)等都有較高的同源性，而與綠海龜(64％)、家貓(59％)、牛(58％)、人(58％)則同源性相對較低。
　　2.團(tuán)頭魴目的基因的時(shí)空表達(dá)譜對團(tuán)頭魴rbp1b、rbp2a、rbp4三個(gè)基因進(jìn)行了熒光

4、定量PCR，得到了三個(gè)基因在團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織中的表達(dá)譜，分析結(jié)果可看出，三種基因在不同組織中的mRNA表達(dá)量存在著顯著差異，rbp1b在腎臟和脾臟中有高表達(dá)，在小腸、眼睛等器官中則表達(dá)量極低或基本未見表達(dá);rbp2a和rbp4則在肝臟中高表達(dá)，其中rbp2a在小腸中有少量表達(dá)，而在眼球中則基本未見表達(dá);rbp4在眼球中有少量表達(dá)，小腸中則基本未見表達(dá)。除此之外，同一基因在不同發(fā)育時(shí)期也會(huì)有明顯的表達(dá)量的變化:rbp1b在團(tuán)

5、頭魴胚胎發(fā)育早期持續(xù)表達(dá)，出膜后7天內(nèi)表達(dá)量持續(xù)升高;rbp2a和rbp4則在胚胎發(fā)育早期表達(dá)量都極低或基木未見表達(dá)，在出膜前后才有較高的表達(dá)。
　　3.團(tuán)頭魴rbp4啟動(dòng)子克隆利用熱不對稱PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)法擴(kuò)增得到團(tuán)頭魴rbp4基因的上游核心啟動(dòng)子序列，同時(shí)對來自三個(gè)不同地理種群樣本進(jìn)行啟動(dòng)子的檢測，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了兩個(gè)SNP位點(diǎn)，-385A＞G以及-32

6、9C＞T，經(jīng)過CRS-PCR(created restriction site PCR)法檢測之后，計(jì)算了三個(gè)不同地理種群中兩個(gè)突變位點(diǎn)的基因型及基因頻率。
　　4.9-順式維甲酸對rbp4啟動(dòng)子活性的影響將單倍型385G-329T和385A-329C構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并通過雙熒光素酶檢測顯示，在一定濃度內(nèi)，9-順式維甲酸對rbp4啟動(dòng)予的活性有明顯的促進(jìn)作用。另外，兩種不同基因型重組載體也存在著差異，低濃度(10 nM)時(shí)p