團(tuán)頭魴野生、選育及馴養(yǎng)群體遺傳變異的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分析.pdf

1、本研究首先通過主要相容性復(fù)合體(Majorhistocopatibilitycomplex，MHC)Ⅰ類α2結(jié)構(gòu)域基因序列，對我國團(tuán)頭魴自然分布區(qū)的4個野生群體、3個選育良種后世代群體(“浦江1號”選育系F7、F8、F9)、1個選育奠基群體(F0)及1個代表性馴養(yǎng)群體(天津換新，HX)的遺傳變異進(jìn)行了比較分析，探討不同生境及人工選育條件下，團(tuán)頭魴遺傳多樣性從野生群體到選育群體到馴養(yǎng)群體的變化趨勢及所受到的選擇壓力。接著，采用快速擴(kuò)增cD

2、NA末端(RACE)技術(shù)，獲得團(tuán)頭魴MHCⅠ類cDNA的全長序列，然后分析了團(tuán)頭魴選育群體與野生群體間MHCⅠ類基因的多態(tài)性。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1、選育群體間MHCⅠ類α2結(jié)構(gòu)域基因的序列分析
　　 ①從F0、F7、F8及F9群體的128尾個體中(各群體有效樣本數(shù)為15～20)共得到長度為225bp(或222bp)的不同核苷酸序列145條(GeneBank序列號為：GU232861-GU233005)

3、，可分為99個等位基因，編碼99條不同的氨基酸序列。群體間的核苷酸、氨基酸序列的同源性分別為52.8％～99.5％、34.6％～98.6％；而群體內(nèi)平均核苷酸/氨基酸序列同源性的值，F(xiàn)9群體(68.8％/59.0％)要低于另外3群體(73.9％～74.4％、66.4％～63.6％)。說明MHCⅠα2結(jié)構(gòu)域基因在團(tuán)頭魴選育后世代群體中具有較高的多態(tài)性，但呈現(xiàn)出隨選育代數(shù)累進(jìn)而逐漸降低的趨勢。②各群體α2結(jié)構(gòu)域總的非同義堿基/同義堿基替換值

4、ω<1(ω=dN/ds)，表明該區(qū)域整體處于凈化選擇(purifyingselection)的壓力之下。在抗原結(jié)合區(qū)(PBR)的ω值，從F0(1.406)到選育群體(F7、F8、F9)逐漸降低(分別為1.168、1.156、1.025)，但均大于1，表明各群體的PBR區(qū)正經(jīng)受正向選擇的壓力，這一點(diǎn)在用CODEML軟件進(jìn)行MHCⅠ類基因選擇壓力的檢測中得到進(jìn)一步的證實(shí)(P<0.01)。③AMOVA分析表明，在遺傳變異的總方差中(以核苷酸序

5、列為例)，有91.13％的差異來自各群體內(nèi)部，僅8.87％的差異來自群體間。三群體團(tuán)頭魴總的遺傳分化指數(shù)(FST)為0.0887(P<0.001)。除F0與F7群體間分化不顯著外(P>0.05)，其余群體間有顯著的遺傳分化(P<0.05或P<0.01)。氨基酸序列的分析結(jié)果與此一致。在以群體間的遺傳距離(K-2P)所構(gòu)建的NJ樹中，F(xiàn)0與F7先聚為一支，再與F8群體聚類，而F9群體則單獨(dú)為一支，顯示它F0于群體的分化越來越明顯。④總之，

6、經(jīng)過20多年的連續(xù)選育，團(tuán)頭魴“浦江1號”后世代群體依然保持了較高的MHC基因多態(tài)性，但PBR的ω值從奠基群體向選育群體逐漸降低并于F9代接近1的事實(shí)表明，隨著選育的持續(xù)進(jìn)行，團(tuán)頭魴選育后世代群體因遺傳漂變作用的逐代增強(qiáng)而漸漸掩蓋了主動選擇作用，并越來越表現(xiàn)出中性選擇作用的傾向
　　 2、野生及馴養(yǎng)群體間MHOⅠ類α2結(jié)構(gòu)域基因的序列分析
　　 ①以團(tuán)頭魴4個野生群體[梁子湖(LZ)、淤泥湖(YN)、石首(SS)、監(jiān)利(

7、JK)]和1個馴養(yǎng)群體(天津換新，HX)為對象，從95尾樣本中(各群體有效樣本數(shù)17～22)，共得到220條長度為225bp或222bp的不同核苷酸序列，可鑒別為123條等位基因(GeneBank序列號為：JF920973～JF921086)，各群體擁有的等位基因數(shù)為29～34。核苷酸、氨基酸序列間同源性的變異范圍較大，分別為50.2％～99.5％、44.0％～98.6％。②各群體內(nèi)的平均核苷酸同源性都很高，在74.65％～76.6％間

8、；而LZ群體的氨基酸序列的平均同源性值最高(75.15％)，其余4群體的值略低(70％～70.65％)。JL和LZ群體的氨基酸多態(tài)位點(diǎn)(Sαα)數(shù)(20～21)比其他3群體的值(14～15)高。氨基酸多態(tài)性(παα)在5群體中的大小順序?yàn)椋篖Z>YN>JL>HX>SS。顯然，在氨基酸變異水平上，HX馴養(yǎng)群體要明顯低于LZ、JL野生群體。⑨各群體MHCⅠ類基因α2結(jié)構(gòu)域的ω值都小于1，表明該區(qū)域總體上處于凈化選擇的壓力之下。各群體PBR區(qū)

9、的ω值在(7.41～1.619)間，都大于1，大小順序?yàn)椋篠S>JL>YN>LZ；而HX馴養(yǎng)群體的ω值(0.6144)卻小于1。說明野生群體受到更強(qiáng)烈的正向選擇作用，從而保持較高的遺傳多態(tài)性；而馴養(yǎng)群體可能受到基因漂變、瓶頸效應(yīng)等的影響，正向選擇作用越來越弱。用CODEML軟件進(jìn)行選擇壓力檢測，再次證實(shí)各群體的MCHⅠ類基因受到顯著的正向選擇作用(P<0.01)。④AMOVA分析表明，從氨基酸序列看，在遺傳變異的總方差中，有85.33％

10、的差異來自各群體內(nèi)部，僅14.67％的差異來自群體間。HX群體與YN群體分化不顯著(P>0.05)，而其余群體間存在顯著的遺傳分化(P<0.01或P<0.05)。在以群體間的K-2P遺傳距離所構(gòu)建的NJ樹中，4個野生群體先聚為一支后再與HX群體聚為一支。
　　 3.團(tuán)頭魴MI-ICⅠ類基因的克隆與多態(tài)性分析
　　 (1)全長cDNA的克隆與組織表達(dá)分析
　　 為了解團(tuán)頭魴MHCⅠ類基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)特性，本研究采用

11、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)技術(shù)，首次成功克隆了團(tuán)頭魴MHCⅠ類cDNA的全長序列。①序列全長為2079bp，含有3’-UTR區(qū)，α1、α2和α3三個結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(TM/CY)及5’-UTR區(qū)。編碼序列長度為1044bp，編碼347個氨基酸。②氨基酸序列預(yù)測表明其具有功能性MHCⅠ分子的典型結(jié)構(gòu)，包括具有N-糖基化位點(diǎn)的α1區(qū)和各含有一對半胱氨酸殘基的α2和α3區(qū)。另外，在α3區(qū)還含有一個極保守的組織相容性復(fù)合體蛋白信號(

12、F/Y-X-C-X-V/A-X-H)。③團(tuán)頭魴具有典型的MHCⅠ類蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)，即由α螺旋和4個反向平行β片層組成的α1、α2區(qū)，二者結(jié)合于分子的頂部構(gòu)成槽狀抗原肽結(jié)合區(qū)域。④在Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹中，團(tuán)頭魴與草魚的親緣關(guān)系最近，與鮭鱒魚類、爬行類、鳥類、哺乳類及人類的親緣關(guān)系則越來越遠(yuǎn)。⑤RT-PCR組織表達(dá)分析表明，團(tuán)頭魴MHCⅠ類基因在所檢測的的8個組織中均有表達(dá)，在鰓、頭腎和血液中有較

13、強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄本，中等強(qiáng)度表達(dá)于肝臟和脾臟，在腎、腸和肌肉中表達(dá)較弱
　　 (2)野生群體、選育群體間MHCⅠ類基因多態(tài)性分析
　　 ①從野生監(jiān)利群體(JL)及“浦江1號”F8選育群體(PJ)的13尾和9尾個體中，共測序96個陽性克隆，得到46條不同的核苷酸序列，長度為987bp～1044bp，編碼329～348個氨基酸。序列包括MHCⅠ類基因的信號肽區(qū)、α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域及胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)。46條核苷酸序列編碼40'條不同

14、的氨基酸序列，可歸為18個等位基因主型、40個等位基因亞型，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。②核苷酸序列中，共存在536個多態(tài)性位點(diǎn)(51.14％)、62個單突變位點(diǎn)、474個簡約突變位點(diǎn)。其中有181個、170個和120個多態(tài)位點(diǎn)分別位于α1區(qū)、α2區(qū)、α3區(qū)。推測的氨基酸序列中，含233個變異位點(diǎn)(68.8％)，單突變位點(diǎn)24個，簡約突變位點(diǎn)199個，其中68個、70個、58個分別位于α1區(qū)、α2區(qū)和α3區(qū)。③等位基因間的平均核苷酸/氨基酸同源

15、性為64.4％175.15％，而α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的核苷酸/氨基酸同源性的變異范圍較大，分別為52.8％～100％/36.7％～100％、52.6％～100％/41.9％～100％和83.3％～100％/71.20～100％。顯然，α1、α2結(jié)構(gòu)域的變異要明顯大于α3結(jié)構(gòu)域。④MHCⅠ類基因編碼區(qū)整體的ω值(0.6016)小于1，表明該基因整體上處于凈化選擇壓力之下。而α2結(jié)構(gòu)域中的PBR區(qū)，JL、PJ群體的ω值分別為2.7875、

16、1.4543，都大于1，且為非PBR區(qū)的ω值的3～10倍，表明團(tuán)頭魴幾野生群體的MHCⅠ類α2結(jié)構(gòu)域比PJ群體的分子受到更大的正向選擇壓力。用CODEML軟件進(jìn)行MHCⅠ類基因選擇壓力檢測，同樣證實(shí)這兩個群體受到正向選擇壓力的作用(P<0.01)。⑤用RDP(Recombinationdetectionprogramme)軟件對各等位基因進(jìn)行基因重組檢測，發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴MHCⅠ類基因中至少有7個重組事件發(fā)生，重組水平較高，而且在各個功能結(jié)構(gòu)