大熊貓主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類(lèi)基因的研究.pdf

1、大熊貓是我國(guó)特有的Ⅰ級(jí)瀕危野生動(dòng)物,被稱(chēng)為“國(guó)寶”,倍受世界矚目。歷史上它曾經(jīng)在我國(guó)有廣泛的分布,但是受冰期和人類(lèi)活動(dòng)的影響,大熊貓的生境越來(lái)越破碎化,到現(xiàn)在僅分布于秦嶺、岷山、邛崍、涼山、大相嶺和小相嶺六個(gè)山系中,其中秦嶺種群已經(jīng)分化成了大熊貓的一個(gè)亞種--秦嶺亞種(Ailuropoda m.qinlingensis)。 作為瀕危動(dòng)物離體保護(hù)的重要內(nèi)容之一,我們構(gòu)建了大熊貓的基因組BAC文庫(kù),以保存大熊貓的珍貴的遺傳資源,同時(shí)

2、為后面開(kāi)展大熊貓的比較基因組學(xué)、基因功能研究打下基礎(chǔ)。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是具有抗原呈遞功能的免疫基因家族,其I類(lèi)和II類(lèi)基因具有重要的適應(yīng)性意義,被應(yīng)用于種群抗病能力的研究。本研究成功地分離出了三個(gè)大熊貓的MHC I類(lèi)基因。主要結(jié)果如下： ·以大熊貓“成功”的新鮮外周血液為材料,成功地構(gòu)建了大熊貓的基因組文庫(kù),共包含205 800個(gè)克隆,保存于2100塊96孔培養(yǎng)板上。對(duì)隨機(jī)挑取的174個(gè)BAC克隆進(jìn)行酶切和大小檢測(cè)

3、,計(jì)算出文庫(kù)的平均插入片段為97kb,空載體率為5.74％。參照黑熊和喜馬拉雅黑熊的基因組大小,本文庫(kù)的基因組覆蓋率為6.8倍,獲得單拷貝基因的概率是99.93％。16對(duì)引物檢測(cè)文庫(kù)陽(yáng)性克隆的數(shù)目范圍為2～16,平均每對(duì)引物的陽(yáng)性克隆數(shù)為6.2。 ·我們采用4D PCR的方法,從文庫(kù)中篩選出目的基因。我們將文庫(kù)分成43個(gè)超級(jí)庫(kù)和1462(43×34)個(gè)1D、2D、3D、4D超級(jí)亞庫(kù)。每對(duì)引物首先通過(guò)43個(gè)PCR反應(yīng)確定陽(yáng)性克隆所

4、在的超級(jí)庫(kù),然后只需要7+7+8+12=77個(gè)PCR反應(yīng),就能從超級(jí)亞庫(kù)中篩選到所需的陽(yáng)性BAC克隆。 ·本研究從大熊貓mRNA和基因組BAC文庫(kù)克隆了三個(gè)MHCI類(lèi)基因,分別定名為Aime-128、Aime-152和Aime-1906?；蚪Y(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析都表明,這三個(gè)基因?qū)儆贛HC I類(lèi)基因家族。 ·Aime-1906是大熊貓非常特殊的一個(gè)非經(jīng)典的I類(lèi)基因,體現(xiàn)在： i.Aim

5、e-1906在外顯子7的起始區(qū)域含有一個(gè)提前的終止子,使得該基因具有縮短的細(xì)胞質(zhì)尾鏈。分析Aime-1906基因外顯子2和3里面哺乳動(dòng)物Ia基因都保守的十個(gè)氨基酸時(shí),發(fā)現(xiàn)只有五處是保守的； ii.外顯子2和3的編碼子第三個(gè)堿基的GC含量分布顯示,Aime-1906比Aime-128和Aime-152都要低,顯示出它更傾向于是1b基因； Ⅲ.外顯子2和3的氨基酸變異顯示,只有約1/3的氨基酸變異是位于抗原結(jié)合區(qū)域的,與經(jīng)典

6、的I類(lèi)基因情況不符； iv.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,Aime-1906與DLA-79親緣關(guān)系更近,顯示出它們可能有著共同的起源關(guān)系,與大熊貓和其它食肉目動(dòng)物的I類(lèi)基因處于完全隔開(kāi)的進(jìn)化枝上,推測(cè)該基因可能有著與其它大熊貓的I類(lèi)基因不-樣的進(jìn)化歷史。 ·Aime-128,Aime-152是屬于大熊貓I類(lèi)基因的兩個(gè)位點(diǎn),體現(xiàn)在： i.基因序列:Aime-128、Aime-152的5’UTR、3’UTR和exon 1都呈現(xiàn)

7、出很大的差異性,序列相似度分別為84％、87％和88％。上游啟動(dòng)子序列分析表明,Aime-128、Aime-152在核心元件enhancer A和W/S都有較大的差異。比較Ia抗原結(jié)合區(qū)保守的十個(gè)氨基酸,Aime-152存在兩個(gè)常規(guī)的氨基酸改變,L5和R146; ii.GC含量檢測(cè):Aime-152抗原結(jié)合區(qū)域和非抗原結(jié)合區(qū)域編碼子的第三個(gè)堿基的GC含量值比Aime-128要??； Ⅲ.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析:Aime-128、A

8、ime-152在用exon2-3構(gòu)建的食肉目系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)里面,都形成了單獨(dú)的進(jìn)化枝。進(jìn)化關(guān)系顯示,大熊貓基因組上還存在著比Aime-152更接近于Aime-128的I類(lèi)位點(diǎn)； ·本研究所獲得的大熊貓的I類(lèi)基因外顯子2和3等位基因抗原結(jié)合區(qū)域的無(wú)義突變和有義突變的置換率(ds、dn)計(jì)算都顯示dn遠(yuǎn)大于ds,表明了大熊貓的I類(lèi)基因也存在著強(qiáng)的平衡選擇； ·本研究顯示,大熊貓的I類(lèi)基因與其它哺乳動(dòng)物的I類(lèi)基因特征相似,是具有多