大熊貓主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類基因的研究.pdf

1、大熊貓是我國特有的Ⅰ級瀕危野生動物,被稱為“國寶”,倍受世界矚目。歷史上它曾經(jīng)在我國有廣泛的分布,但是受冰期和人類活動的影響,大熊貓的生境越來越破碎化,到現(xiàn)在僅分布于秦嶺、岷山、邛崍、涼山、大相嶺和小相嶺六個山系中,其中秦嶺種群已經(jīng)分化成了大熊貓的一個亞種--秦嶺亞種(Ailuropoda m.qinlingensis)。 作為瀕危動物離體保護的重要內(nèi)容之一,我們構(gòu)建了大熊貓的基因組BAC文庫,以保存大熊貓的珍貴的遺傳資源,同時

2、為后面開展大熊貓的比較基因組學(xué)、基因功能研究打下基礎(chǔ)。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是具有抗原呈遞功能的免疫基因家族,其I類和II類基因具有重要的適應(yīng)性意義,被應(yīng)用于種群抗病能力的研究。本研究成功地分離出了三個大熊貓的MHC I類基因。主要結(jié)果如下： ·以大熊貓“成功”的新鮮外周血液為材料,成功地構(gòu)建了大熊貓的基因組文庫,共包含205 800個克隆,保存于2100塊96孔培養(yǎng)板上。對隨機挑取的174個BAC克隆進行酶切和大小檢測

3、,計算出文庫的平均插入片段為97kb,空載體率為5.74％。參照黑熊和喜馬拉雅黑熊的基因組大小,本文庫的基因組覆蓋率為6.8倍,獲得單拷貝基因的概率是99.93％。16對引物檢測文庫陽性克隆的數(shù)目范圍為2～16,平均每對引物的陽性克隆數(shù)為6.2。 ·我們采用4D PCR的方法,從文庫中篩選出目的基因。我們將文庫分成43個超級庫和1462(43×34)個1D、2D、3D、4D超級亞庫。每對引物首先通過43個PCR反應(yīng)確定陽性克隆所

4、在的超級庫,然后只需要7+7+8+12=77個PCR反應(yīng),就能從超級亞庫中篩選到所需的陽性BAC克隆。 ·本研究從大熊貓mRNA和基因組BAC文庫克隆了三個MHCI類基因,分別定名為Aime-128、Aime-152和Aime-1906?；蚪Y(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、啟動子分析、系統(tǒng)進化樹分析都表明,這三個基因?qū)儆贛HC I類基因家族。 ·Aime-1906是大熊貓非常特殊的一個非經(jīng)典的I類基因,體現(xiàn)在： i.Aim

5、e-1906在外顯子7的起始區(qū)域含有一個提前的終止子,使得該基因具有縮短的細胞質(zhì)尾鏈。分析Aime-1906基因外顯子2和3里面哺乳動物Ia基因都保守的十個氨基酸時,發(fā)現(xiàn)只有五處是保守的； ii.外顯子2和3的編碼子第三個堿基的GC含量分布顯示,Aime-1906比Aime-128和Aime-152都要低,顯示出它更傾向于是1b基因； Ⅲ.外顯子2和3的氨基酸變異顯示,只有約1/3的氨基酸變異是位于抗原結(jié)合區(qū)域的,與經(jīng)典

6、的I類基因情況不符； iv.系統(tǒng)進化樹分析表明,Aime-1906與DLA-79親緣關(guān)系更近,顯示出它們可能有著共同的起源關(guān)系,與大熊貓和其它食肉目動物的I類基因處于完全隔開的進化枝上,推測該基因可能有著與其它大熊貓的I類基因不-樣的進化歷史。 ·Aime-128,Aime-152是屬于大熊貓I類基因的兩個位點,體現(xiàn)在： i.基因序列:Aime-128、Aime-152的5’UTR、3’UTR和exon 1都呈現(xiàn)

7、出很大的差異性,序列相似度分別為84％、87％和88％。上游啟動子序列分析表明,Aime-128、Aime-152在核心元件enhancer A和W/S都有較大的差異。比較Ia抗原結(jié)合區(qū)保守的十個氨基酸,Aime-152存在兩個常規(guī)的氨基酸改變,L5和R146; ii.GC含量檢測:Aime-152抗原結(jié)合區(qū)域和非抗原結(jié)合區(qū)域編碼子的第三個堿基的GC含量值比Aime-128要??； Ⅲ.系統(tǒng)進化樹分析:Aime-128、A

8、ime-152在用exon2-3構(gòu)建的食肉目系統(tǒng)進化樹里面,都形成了單獨的進化枝。進化關(guān)系顯示,大熊貓基因組上還存在著比Aime-152更接近于Aime-128的I類位點； ·本研究所獲得的大熊貓的I類基因外顯子2和3等位基因抗原結(jié)合區(qū)域的無義突變和有義突變的置換率(ds、dn)計算都顯示dn遠大于ds,表明了大熊貓的I類基因也存在著強的平衡選擇； ·本研究顯示,大熊貓的I類基因與其它哺乳動物的I類基因特征相似,是具有多