CB1受體介導(dǎo)STAT3磷酸化上調(diào)SOD2參與電針預(yù)處理腦保護(hù)的研究.pdf

1、近年來缺血性腦卒中發(fā)病率、致死率以及致殘率均居高不下,已成為導(dǎo)致人類死亡的“第二大殺手”。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的主要病理生理機(jī)制之一,抑制氧化應(yīng)激能夠有效減輕缺血再灌注損傷。作為體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成,內(nèi)源性/外源性激活SOD2能夠有效減輕氧化應(yīng)激。SOD2也是諸多非缺血預(yù)處理措施誘導(dǎo)腦保護(hù)效應(yīng)的靶點(diǎn)之一。作為非缺血預(yù)處理的重要組成,電針預(yù)處理因其安全性高、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是潛在的可靠防護(hù)缺血性腦卒中有效措施,而且其作用

2、機(jī)制也被證實(shí)同樣與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)。但電針預(yù)處理是否也通過激活SOD2信號(hào)發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)并不明確,而且電針預(yù)處理調(diào)控SOD2激活的上游信號(hào)機(jī)制也尚未清楚。
　　基于前期研究,為解決上述問題,本課題將重點(diǎn)回答:1.電針預(yù)處理是否通過上調(diào)SOD2表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受;2.氧化應(yīng)激損傷是造成缺血再灌注損傷的重要機(jī)制,電針預(yù)處理激活SOD2是否通過減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)?3.STAT3已被報(bào)道證實(shí)為 SOD2的上游調(diào)控分子,我們前期研

3、究證實(shí)電針預(yù)處理通過CB1受體調(diào)節(jié)STAT3磷酸化,那么電針預(yù)處理對(duì)STAT3/SOD2的調(diào)控是否也由CB1受體介導(dǎo)?
　　本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證電針預(yù)處理是否影響腦缺血再灌注損傷后SOD2的表達(dá)。其次,研究電針預(yù)處理對(duì)SOD2激活的上游調(diào)控機(jī)制:探尋電針預(yù)處理是否通過CB1受體介導(dǎo)STAT3上調(diào)SOD2表達(dá),激活抗氧化系統(tǒng),減輕氧化應(yīng)激損傷,最終發(fā)揮腦保護(hù)作用。從而為電針等非缺血性預(yù)處理腦保護(hù)措施分子機(jī)制揭示做出貢獻(xiàn),也為其臨床應(yīng)用推廣

4、提供更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù),奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一:電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響
　　目的:
　　明確電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響
　　方法:
　　將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組:假手術(shù)組(sham組)、單純電針組(EA組)、模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組)。Sham組:腹腔注射10％水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后,行假手術(shù);EA

5、組:腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,取“百會(huì)穴”,疏密波、2/15Hz、1mA,持續(xù)電刺激30min,電針2h后取材;MCAO組:麻醉后進(jìn)行MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌;EA+MCAO組:麻醉后取“百會(huì)穴”,持續(xù)電針30min,電針后2h進(jìn)行MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1h后進(jìn)行再灌。
　　所有小鼠將于缺血再灌注2h后取材,進(jìn)行western-blot、免疫熒光檢測(cè)SOD2表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.電

6、針預(yù)處理上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2蛋白表達(dá)
　　Western-blot顯示缺血再灌注2h后,與sham組相比,EA組SOD2表達(dá)無明顯變化,而MCAO組SOD2表達(dá)明顯下降(P<0.05);與MCAO組相比,EA+MCAO組SOD2表達(dá)明顯升高(P<0.05)。
　　2.電針預(yù)處理增強(qiáng)神經(jīng)元SOD2免疫熒光強(qiáng)度免疫熒光結(jié)果顯示,缺血再灌注2h后,與sham組相比,EA組SOD2免疫熒光強(qiáng)度無明顯改變,而MCAO組SOD

7、2免疫熒光減弱;與MCAO組相比,電針預(yù)處理則增加了SOD2免疫熒光強(qiáng)度,SOD2與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN重疊增加。
　　結(jié)論:
　　電針預(yù)處理可以上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元SOD2的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:電針預(yù)處理上調(diào)SOD2減輕氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)腦缺血耐受
　　目的:
　　1.驗(yàn)證SOD2-siRNA下調(diào)SOD2表達(dá)是否逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化作用
　　2.驗(yàn)證SOD2-siRNA是否逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦

8、保護(hù)效應(yīng)
　　方法:
　　1.驗(yàn)證SOD2-siRNA干擾效能
　　將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組:對(duì)照組(sham組)、溶劑組(vehicle組)、SOD2-siRNA組、control siRNA組。Sham組:腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,僅行假手術(shù);SOD2-siRNA組、control siRNA組、vehicle組:腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,分別給予側(cè)腦室注射SOD2-siRNA、control

9、 siRNA和溶劑。側(cè)腦室注射72 h后,取缺血半暗帶相應(yīng)位置進(jìn)行western-blot。
　　2.SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化效應(yīng)
　　將48只雄性C57BL/6小鼠分為6組:假手術(shù)組(sham組)、單純電針組(EA組)、模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組)、SOD2-siRNA組(EA+SOD2-siRNA組)、control siRNA組(EA+control siRNA組),其中sh

10、am組、MCAO組、EA組、EA+MCAO組處理方法如前所述;EA+SOD2-siRNA組、control siRNA組:腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,分別進(jìn)行側(cè)腦室注射SOD2-siRNA、control siRNA,72h后進(jìn)行MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌。缺血再灌注24h后,取缺血半暗帶進(jìn)行Elisa檢測(cè),測(cè)定ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量,以及DHE染色觀察超氧陰離子表達(dá)情況。
　　

11、3.SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)
　　將36只雄性C57BL/6小鼠分為6組:假手術(shù)組(sham組)、單純電針組(EA組)、模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組)、SOD2-siRNA組(EA+SOD2-siRNA組)、control siRNA組(EA+control siRNA組),其處理方法如前所述。缺血再灌注24 h后取材,進(jìn)行TTC染色、腦梗死容積百分比、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(Longa評(píng)分)

12、、TUNEL染色。
　　結(jié)果:
　　1.SOD2-siRNA明顯下調(diào)小鼠腦內(nèi)SOD2表達(dá)
　　Western-blot結(jié)果顯示與sham組相比,vehicle組和control siRNA組SOD2表達(dá)無明顯變化,而SOD2-siRNA組SOD2表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
　　2.SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的抗氧化效應(yīng)
　　Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示:與sham組相比,MCAO組ROS、MDA、8-

13、OHdG、nitrotyrosine含量均明顯升高(P<0.05);與MCAO組相比,EA+MCAO組ROS、MDA、8-OH-dG、nitrotyrosine含量均明顯降低(P<0.05);而與EA+MCAO組相比,EA+SOD2-siRNA組ROS、MDA、8-OHdG、nitrotyrosine含量均明顯升高(P<0.05)。
　　DHE染色結(jié)果與Elisa結(jié)果相一致,與sham組相比,MCAO組超氧陰離子熒光強(qiáng)度明顯增加;

14、與MCAO組相比,EA+MCAO組熒光強(qiáng)度明顯降低;與EA+MCAO組相比,而EA+SOD2-siRNA組熒光強(qiáng)度明顯增加。
　　3.SOD2-siRNA逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:與MCAO組相比,EA+MCAO組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05);與EA+MCAO組相比,而EA+SOD2-siRNA組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05)。腦梗死容積百分比:與MCAO組相比,EA+MCAO組的腦梗

15、死容積百分比明顯減小(P<0.05);與EA+MCAO組相比,EA+SOD2-siRNA組腦梗死容積百分比明顯增大(P<0.05)。TUNEL染色:與MCAO組相比,EA+MCAO組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05);與EA+MCAO組相比,EA+SOD2-siRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　電針預(yù)處理通過上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá),減輕氧化應(yīng)激損傷,抑制缺血后神經(jīng)元凋亡從而誘導(dǎo)腦缺

16、血耐受。
　　實(shí)驗(yàn)三:電針預(yù)處理通過CB1受體介導(dǎo)STAT3磷酸化上調(diào)SOD2
　　目的:
　　1.驗(yàn)證大麻素CB1受體在電針預(yù)處理上調(diào)缺血再灌注損傷后SOD2表達(dá)中的作用
　　2.明確轉(zhuǎn)錄因子STAT3在電針預(yù)處理上調(diào)缺血再灌注損傷后SOD2表達(dá)中的作用
　　方法:
　　1.CB1受體抑制劑AM251、SR141716對(duì)電針預(yù)處理后SOD2表達(dá)的影響
　　將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組

17、:模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組)、AM251預(yù)處理組(EA+AM251組)、SR141716預(yù)處理組(EA+SR141716組)、溶劑組(EA+vehicle組),其中MCAO組、EA+MCAO組處理方法如前所述;EA+AM251組、EA+vehicle組:分別給予AM251(1mg/kg)和溶劑腹腔注射30min后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,持續(xù)電針30min,電針后2h進(jìn)行MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1h后

18、再灌。EA+SR141716組:麻醉后,持續(xù)電針30min,電針后2h進(jìn)行MCAO模型,模型后30min給予SR141716(1mg/kg),缺血1h后再灌。所有小鼠缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。
　　2.CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2對(duì)小鼠腦缺血再灌注后SOD2表達(dá)的影響
　　將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組:模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組)、ACE

19、A預(yù)處理組(MCAO+ACEA組)、WIN55,212-2預(yù)處理組(MCAO+WIN組)、溶劑組(MCAO+vehicle組),其中MCAO組、EA+MCAO組、處理方法如前所述;MCAO+ACEA組、MCAO+WIN組、MCAO+vehicle組:分別給予ACEA(2.5mg/kg)、WIN55,212-2(1.5mg/kg)和溶劑腹腔注射30min后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,進(jìn)行MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌。缺血再灌注

20、2 h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。
　　3.電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影響
　　將24只雄性C57BL/6小鼠分為4組:假手術(shù)組(sham組)、單純電針組(EA組)、模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組),其處理方法如前所述。缺血再灌注2h后取材,進(jìn)行western-blot觀察STAT3磷酸化水平變化情況。
　　4.CB1受體抑制劑AM251、SR141716

21、對(duì)電針預(yù)處理后pSTAT3水平的影響
　　將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組:模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組（EA+MCAO組)、AM251預(yù)處理組（EA+AM251組)、SR141716預(yù)處理組(EA+SR141716組)、溶劑組(EA+vehicle組),其處理如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。
　　5.CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2對(duì)小鼠腦缺血再灌注后pSTA

22、T3水平的影響
　　將30只雄性C57BL/6小鼠分為5組:模型組(MCAO組)、電針預(yù)處理組(EA+MCAO組)、ACEA預(yù)處理組(MCAO+ACEA組)、WIN55,212-2預(yù)處理組(MCAO+WIN組)、溶劑組(MCAO+vehicle組),其處理方法如前所述。缺血再灌注2h后取缺血半暗帶進(jìn)行western-blot。
　　結(jié)果:
　　1.CB1受體抑制劑AM251、SR141716可下調(diào)電針預(yù)處理后SOD2的

23、表達(dá)
　　給予CB1受體抑制劑AM251、SR141716后,western-blot結(jié)果顯示與MCAO組相比,EA+MCAO組 SOD2表達(dá)均明顯增加(P<0.05);與 EA+MCAO組相比,EA+AM251組和EA+SR141716組SOD2表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。
　　2.CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2可上調(diào)小鼠腦缺血再灌注后SOD2的表達(dá)
　　給予CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55

24、,212-2后,western-blot結(jié)果顯示與MCAO組相比,MCAO+ACEA組、MCAO+WIN組SOD2表達(dá)明顯增加(P<0.05)。
　　3.電針預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影響
　　缺血再灌注2 h后,與sham組相比,EA組pSTAT3水平無明顯變化,而MCAO組pSTAT3表達(dá)明顯下降(P<0.05);與MCAO組相比,EA+MCAO組pSTAT3表達(dá)明顯升高(P<0.05)。
　

25、　4.CB1受體抑制劑AM251、SR141716可降低電針針預(yù)處理后pSTAT3 水平
　　給予CB1受體抑制劑AM251、SR141716后，結(jié)果顯示與MCAO組相比，
　　EA+MCAO組pSTAT3 水平均明顯升高（P<0.05）；與EA+MCAO組相比，EA+AM251組和EA+SR141716組pSTAT3水平均明顯降低（P<0.05）。
　　5.CB1受體激動(dòng)劑ACEA、WIN55,212-2可升高小鼠腦