sFcγRⅡb蛋白表達及其結(jié)合肽篩選.pdf

1、FcγRIIb為免疫球蛋白超家族成員，是唯一的抑制型Fc受體，主要通過與激活型受體交聯(lián)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號，對于體內(nèi)的免疫平衡發(fā)揮著重要的作用。以FcγRIIb為靶點進行的研究對于探索自身免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病的發(fā)病機制及相關(guān)疾病的藥物開發(fā)具有重要意義。
　　本研究分為兩個部分：第一部分：sFcγRIIb基因克隆與表達。提取RBL-2H3細胞總RNA，采用RT-PCR技術(shù)克隆FcγRIIb基因，構(gòu)建了克隆載體FcγRIIb-

2、pUCm-T。我們亞克隆FcγRIIb胞外區(qū)基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒sFcγRIIb-pET17b，采用CaCl2介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒sFcγRIIb-pET17b轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，進行表達。通過對表達體系進行優(yōu)化，確定IPTG濃度為1.0mM，誘導(dǎo)時間為4h時蛋白表達效率最高。SDS-PAGE檢測重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)Triton X-100和2M尿素清洗后，8M尿素溶液溶解，利用Ni-NTA柱親和層析獲得了

3、較高純度的重組蛋白。采用梯度透析復(fù)性法對sFcγRIIb進行復(fù)性后，經(jīng)Western Blot和ELISA法鑒定，結(jié)果表明重組蛋白sFcγRIIb能被特異性抗體所識別且與IgG在體外具有結(jié)合能力，表明成功制備了具有正常生物學(xué)功能的重組蛋白。第二部分：sFcγRIIb結(jié)合肽篩選。采用噬菌體肽庫展示技術(shù)對sFcγRIIb結(jié)合肽進行篩選。利用ELISA鑒定每輪洗脫噬菌體與sFcγRIIb蛋白親和力，經(jīng)過四輪篩選，挑取40個噬菌體克隆進行序列測