轉(zhuǎn)錄因子RFX1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用研究.pdf

1、研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種病變累及多系統(tǒng)、多器官,嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病。然而SLE確切的病因及發(fā)病機理尚不明確。越來越多的研究表明表觀遺傳機制,特別是DNA低甲基化在調(diào)控T細胞自身免疫相關(guān)基因表達及SLE發(fā)病中起著十分重要的作用。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA調(diào)控。DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)機制之一,在胚胎發(fā)育、基因印跡、

2、X染色體失活、調(diào)節(jié)基因的表達及DNA與蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變等方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明在體外抑制T細胞DNA甲基化,可使T細胞甲基化敏感基因調(diào)控序列特定區(qū)域低甲基化,從而導(dǎo)致基因過度表達。這些基因包括CD11a(ITGAL)、perforin(PRF1)、CD70(TNFSF7)及CD40 ligand(TNFSF5)。研究發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血CD4+T細胞中CD11a、CD70等基因表達異常升高。而過度表達這些基

3、因的T細胞具有自身反應(yīng)性,殺傷自身巨噬細胞或輔助B細胞產(chǎn)生大量的自身抗體,在動物體內(nèi)能誘導(dǎo)狼瘡樣疾病。目前研究己證實CD70和CD11a等基因過度表達是導(dǎo)致T淋巴細胞異?；罨拖到y(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病的重要機制之一,然而上述基因過度表達的分子機制尚未完全闡明。我們通過轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)SLE患者CD4+T細胞中存在多個具有差異活性的轉(zhuǎn)錄因子,如RFX1和SRF。進一步研究我們證實轉(zhuǎn)錄因子RFX1的表達和活性在SLE患者CD4

4、+T細胞中顯著下調(diào)。生物信息學(xué)預(yù)測CD70和CD11a基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在RFX1結(jié)合位點,提示RFX1可能參與調(diào)控SLECD4+T細胞中CD11a和CD70等自身免疫相關(guān)基因的表達。本研究我們通過轉(zhuǎn)基因和RNA干擾的方法揭示轉(zhuǎn)錄因子RFX1在SLE發(fā)病過程中的作用,該研究將有助于進一步闡明SLE發(fā)病的分子機制,并有可能為SLE的治療提供新的思路和途徑。
　　 第一部分篩選、鑒定具有差異活性的轉(zhuǎn)錄因子
　　 目的：利

5、用轉(zhuǎn)錄因子芯片高通量篩選在SLE患者CD4+T細胞和健康對照之間具有差異活性的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 方法：密度梯度離心分離6例SLE患者和6例正常人的外周血單個核細胞,磁珠分選CD4+T細胞,提取核蛋白,采用CapitalBio公司提供的含有225個轉(zhuǎn)錄因子探針的微陣列篩選SLE患者和正常人之間具有差異活性的轉(zhuǎn)錄因子。提取9例SLE患者和9例正常對照的CD4+T細胞核蛋白,利用轉(zhuǎn)錄因子-酶聯(lián)免疫吸附試驗(Transcriptiona

6、l factors-enzyme linked immunosorbent assay,TFs-ELISA)檢測轉(zhuǎn)錄因子的活性。收集31名活動期SLE患者和33名健康對照人群的外周血CD4+T細胞,采用Qiagen公司的RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA,實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,real-tim

7、eRT-PCR)檢測mRNA表達水平；抽提CD4+T細胞總蛋白,Westernblot檢測蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)錄因子芯片檢測結(jié)果顯示:與健康對照相比,轉(zhuǎn)錄因子RFX1、SRF、MIF1在SLE患者CD4+T細胞中轉(zhuǎn)錄活性分別下降2.55±0.18,2.85±0.28和3.03±0.4倍；而轉(zhuǎn)錄因子E4BP4活性升高1.58±0.25倍。進一步的TFs-ELISA實驗證實:SLE患者CD4+T細胞中RFX1和SRF轉(zhuǎn)錄活

8、性顯著下降,與芯片結(jié)果一致。Real-time RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示:與正常對照相比,SLE患者CD4+T細胞中RFX1基因mRNA、蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01),SRF蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：SLE患者CD4+T細胞中多個轉(zhuǎn)錄因子活性發(fā)生改變,其中轉(zhuǎn)錄因子RFX1和SRF的活性和表達水平較健康對照均顯著性降低,提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能在SLE發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

9、
　　 第二部分:轉(zhuǎn)錄因子RFX1在SLE發(fā)病中的作用
　　 第一節(jié)特異性抑制RFX1可誘導(dǎo)正常CD4+T細胞自身反應(yīng)性
　　 目的：特異性抑制轉(zhuǎn)錄因子RFX1表達對正常CD4+T細胞中自身免疫相關(guān)基因CD11a和CD70的表達水平及其刺激B細胞產(chǎn)生自身抗體的影響。
　　 方法：構(gòu)建特異性抑制RFX1表達的RNA干擾載體(pSUPER.RFX1),利用Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒大量抽提質(zhì)粒,Lonz

10、a公司的人T細胞轉(zhuǎn)染試劑盒和Amaxa nucleofector細胞轉(zhuǎn)染儀用于T細胞轉(zhuǎn)染。Western blot檢測RFX1蛋白的表達水平,Real-time RT-PCR法檢測CD11a和CD70基因mRNA的表達水平,流式細胞儀檢測CD11a和CD70基因的蛋白表達水平。T細胞和同源B細胞(1:4)孵育,37℃培養(yǎng)8天,收集細胞培養(yǎng)液,ELISA法檢測抗體IgG的濃度。
　　 結(jié)果：與對照組相比,轉(zhuǎn)染干擾載體pSUPER.

11、RFX1的正常CD4+T細胞RFX1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(mean fluorescence intensity,MFI)水平則顯著升高(P<0.01),轉(zhuǎn)染干擾載體pSUPER.RFX1的正常CD4+T細胞與自身B細胞孵育,B細胞產(chǎn)生IgG抗體產(chǎn)量顯著增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：下調(diào)RFX1表達可導(dǎo)致CD4+T細胞自身免疫相關(guān)基因CD11a和CD70表達升高,誘

12、導(dǎo)B細胞產(chǎn)生大量自身抗體。
　　 第二節(jié)過表達RFX1可抑制SLE患者CD4+T細胞自身反應(yīng)性
　　 目的：過表達轉(zhuǎn)錄因子RFX1對SLE患者CD4+T細胞自身免疫相關(guān)基因CD11a和CD70的表達以及其刺激B細胞產(chǎn)生自身抗體的影響。
　　 方法：構(gòu)建RFX1真核表達載體pSG5-RFX1,Lonza公司的人T細胞轉(zhuǎn)染試劑盒和Amaxa nucleofector細胞轉(zhuǎn)染儀用于T細胞轉(zhuǎn)染。Western blot檢

13、測RFX1蛋白的表達水平,Real-time RT-PCR法檢測CD11a和CD70基因mRNA水平,流式細胞儀檢測CD11a和CD70蛋白水平,T、B細胞孵育實驗及ELISA法檢測自身抗體IgG產(chǎn)量。
　　 結(jié)果：與對照組相比,轉(zhuǎn)染pSG5-RFX1的SLE患者CD4+T細胞RFX1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(MFI)水平顯著降低(P<0.01),轉(zhuǎn)染pSG5-RFX1的SLE