NEK7-NLRP3炎性小體信號通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用.pdf

1、研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)多見于育齡期青年女性，病理變化以炎癥反應、血管異常為主的慢性自身免疫性疾病。環(huán)境及遺傳因素、激素水平和免疫調節(jié)因子等多種機制參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，固有免疫及適應性免疫系統(tǒng)均在SLE發(fā)病過程中扮演重要角色。作為人體重要的免疫屏障系統(tǒng)，固有免疫系統(tǒng)具有清除外來病原體和激活適應性免疫應答的作用。通過模式識別受體(patternrecognitionrece

2、ptors，PRRs)，固有免疫系統(tǒng)識別病原體相關分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)發(fā)揮屏障作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRRs中，一些NOD樣受體(nucleotidebindingoligome-rizationdomain-likereceptors，NLRs)被激活后形成一種胞內高分子量蛋白復合體，稱為“炎性小體”或“炎癥小體”。炎性小體可以激活半胱天冬酶-1(cysteinyl

3、aspartate-specificproteinase，Caspase-1)，誘導白介素-1beta(interleukin-1beta，IL-1b)、白介素18（interleukin-18，IL-18）的產(chǎn)生及活化，參與調節(jié)機體的免疫、炎癥反應。已報道的炎性小體主要有四種:Nod樣受體蛋白1(Nod-likereceptorprotein1，NLRP1)、Nod樣受體蛋白3(Nod-likereceptorprotein3，NLR

4、P3)、IPAF(ice-protease-activatingfactor,IPAF)及AIM2(absentinmelanoma2,AIM2),其中NLRP3炎性小體能夠被多種病原體激活，如細菌、病毒、代謝產(chǎn)物、結晶體等，是目前研究最廣泛的炎性小體。在本課題組先前的研究中發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中NLRP3炎性小體呈低表達，且與疾病活動呈負相關，給予藥物

5、治療后NLRP3炎性小體組分表達量顯著升高，提示其可能在SLE發(fā)病中起到保護性作用，但具體機制不詳。近期，研究發(fā)現(xiàn)NIMA相關蛋白激酶7(neverinmitosisgeneArelatedkinase7，NEK7)，一種具有調控細胞周期、促進細胞有絲分裂功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是激活NLRP3炎性小體的關鍵蛋白。
　　目的:探討NEK7-NLRP3炎性小體信號通路在SLE患者PBMC中的表達及其臨床意義。
　　方法:

6、選取2016年03月至2016年11月期間就診于山東大學附屬省立醫(yī)院風濕免疫科的SLE患者38例（SLE組）及同期就診于該院杏體中心的健康人33例（健康對照組）。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-timePolymeraseChainReaction，real-timePCR)法和免疫印跡試驗(westernblotting)檢測兩組研究對象PBMC中NEK7、NLRP3炎性小體各組分（NLRP3、ASC、Caspase-1）及

7、下游因子IL-1b、IL-18的mRNA、蛋白表達量，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunesorbentassay，ELISA)檢測其血清IL-1b、IL-18表達量。采用同種方法檢測25例治療后SLE患者上述指標的表達量，分析治療前后相關組分的變化，探討其與SLE病情活動評價指標的相關性。
　　結果:
　　1.RT-PCR實驗結果顯示，與健康對照組相比，SLE組PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRN

8、A呈低表達(P=0.0004;P=0.0001;P=0.0005)，而Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA呈高表達(P=0.0001)。
　　2.Westernblotting實驗結果顯示，與健康對照組相比，SLE組PBMC中NEK7、NLRP3蛋白呈低表達(P=0.0317;P=0.0079)，ASC蛋白表達無差異(P=0.8413)，而Caspase-1、IL-1b、IL-18蛋白呈高表達(P=0.0159;P=

9、0.009;P=0.016)。
　　3.ELISA實驗結果顯示，SLE組血清IL-1b、IL-18表達量顯著高于健康對照組(P=0.000)，治療后IL-1b、IL-18的表達水平明顯下降(P=0.000)。治療后SLE組血清IL-1b的表達量仍高于健康對照組(P=0.002)，而治療后IL-18的表達量較健康對照組無明顯差異(P=0.495)。
　　4.SLE組PBMC中NEK7、NLRP3炎性小體各組分及其下游細胞因子m

10、RNA表達量之間的相關分析
　　4.1SLE組PBMC中，NEK7與NLRP3、ASCmRNA表達量存在正相關(r=0.3728，P=0.0274;r=0.4454,P=0.0073)，而與Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表達量無相關性(r=-0.2930，P=0.0876;r=0.06625，P=0.7053;r=-0.1063,P=0.5433)。
　　4.2SLE組PBMC中，NLRP3與ASCmRN

11、A表達量存在正相關(r=0.7157,P=0.0001)，而與Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表達量均無相關性(r=-0.1521,P=0.3831;r=0.05126,P=0.7699;r=0.1441,P=0.4088)。
　　4.3SLE組PBMC中，ASCmRNA表達量與Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表達量均無相關性(r=-0.2000,P=0.2494;r=-0.02479,P=0.

12、8876;r=0.1583,P=0.3638)。
　　4.4SLE組PBMC中，Caspase-1mRNA表達量與IL-1b、IL-18mRNA表達量存在正相關(r=0.4790,P=0.0036;r=0.7090,P=0.0001);IL-1brnRNA表達量與IL-18mRNA表達量亦存在正相關(r=0.4996,P=0.0022)。
　　5.SLE組PBMC中NEK7、NLRP3炎性小體各組分及其下游細胞因子mRNA表

13、達量與SLE病情活動評價指標（抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLEDAI評分）的相關分析
　　5.1SLE組PBMC中，NEK7mRNA水平與抗AnuA抗體呈負相關(r=-0.5630,P=0.0006)，與抗ds-DNA抗體、SLEDAI評分無相關性(r=-0.2701、-0.2692,P=0.1166、0.2034)。
　　5.2SLE組PBMC中，NLRP3mRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLE

14、DAI評分均呈負相關(r=-0.5453、-0.7087、-0.7430,P=0.0007、0.0001、0.0001)。
　　5.3SLE組PBMC中，ASCmRNA水平與抗ds-DNA抗體無相關性(r=-0.3261,P=0.0559)，與抗AnuA抗體和SLEDAI評分呈負相關(r=-0.3722、-0.7667,P=0.0277、0.0001)。
　　5.4SLE組PBMC中，Caspase-1mRNA水平與抗ds-

15、DNA抗體及SLEDAI評分無相關性(r=0.2281、0.1533,P=0.1876、0.3794)，與抗AnuA抗體呈正相關(r=0.4361,P=0.0088)。
　　5.5SLE組PBMC中，IL-1bmRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體無相關性(r=-0.0230、0.1888,P=0.8956、0.2774),與SLEDAI評分呈正相關(r=0.7953,P=0.0001)。
　　5.6SLE組PBM

16、C中，IL-18mRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLEDAI評分均呈正相關(r=0.4177、0.3498、0.5259,P=0.0125、0.0394、0.0012)。
　　6.ELISA實驗結果相關分析表明，SLE組血清IL-1b表達量與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體、ESR及SLEDAI評分均呈正相關(r=0.584、0.504、0.566、0.624;P=0.002、0.010、0.003、0.001

17、),與C3呈負相關(r=-0.398,P=0.049);SLE組血清IL-18表達量與抗ds-DNA抗體、ESR及SLEDAI評分亦呈正相關(r=0.544、0.512、0.612;P=0.005、0.009、0.010)。
　　7.藥物治療后，SLE組PBMC中NEK7、NLRP3mRNA表達量較前升高:1.1189±0.5017vs2.4685±0.9712(P=0.025)、0.5726±0.1718vs0.9682±0.2

18、675(P=0.024);ASCmRNA表達量治療前后未見明顯差異:1.0350±0.6351vs1.2686±0.8319(P=0.634);Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表達量治療后較治療前明顯降低:1.6419±0.3514vs0.7687±0.2223(P=0.002)、7.1753±2.2051vs3.2899±1.3161(P=0.010)、3.3933±0.8431vs1.4175-0.2151(P=0

19、.001)。
　　8.藥物治療后，SLE組PBMC中NEK7、NLRP3蛋白表達量較前升高:1.9415±0.4547vs3.0900±0.8325(P=0.027)、0.5056±0.3042vs1.0066±0.2865(P=0.046):ASC蛋白表達量治療前后未見明顯差異:0.8152±0.2222vs0.9048±0.1032(P=0.437);Caspase-1、IL-1b及IL-18蛋白表達量較治療前顯著降低:2.4

20、149±0.6172vs1.2169±0.3724(P=0.006)、4.0684±0.0855vs3.7134±0.1129(P=0.001)、2.7540±0.8599vs2.5211±0.1986(P=0.043)。
　　9.與SLE無腎損害組相比，LN組PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRNA呈低表達:1.8173±0.7953vs1.0187±0.3036(P=0.002)、0.7432±0.2791vs0.461

21、2±0.2317(P=0.004)、1.1426±0.4972vs0.7455±0.2536(P=0.012);Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA呈高表達:1.4763±0.5189vs2.5654±0.6186(P=0.000)、3.0022±2.0904vs7.6056±4.7246(P=0.000)、2.6668±1.4962vs5.9491±3.3549(P=0.000)。
　　10.與SLE無腎損害組相比

22、，LN組PBMC中NEK7、NLRP3、ASC蛋白呈低表達:2.4661±0.8916vs1.7945±0.9244(P=0.010)、0.8669±0.1290vs0.4779±0.1400(P=0.001)、1.1628±0.2963vs0.7191±0.1434(P=0.008);Caspase-1、IL-1b、IL-18蛋白呈高表達:2.1471±0.9455vs3.5734±0.9081(P=0.024)、3.1865±1.0

23、688vs4.8724±0.8605(P=0.013)、2.6391±0.4480vs3.8800±0.3223(P=0.000)。
　　結論:
　　1.NEK7-NLRP3復合體的低表達與SLE疾病活動呈負相關，可能作為保護性因素參與SLE、LN的發(fā)病。
　　2.SLE患者PBMC中NEK7對NLRP3呈正性激活作用，NLRP3的低表達可能與其NEK7的低表達有關。
　　3.SLE患者PBMC中Caspase-