MicroRNA-1246調(diào)控B細(xì)胞活化及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）是一種累及多器官、多系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病。其主要發(fā)病機制為B細(xì)胞過度活化產(chǎn)生大量自身抗體，與自身抗原形成免疫復(fù)合物，沉積于多器官，造成其炎癥反應(yīng)和組織損傷。SLE的發(fā)病與多種因素有關(guān)，如遺傳、性激素、吸煙、感染、藥物等環(huán)境因素，其確切的發(fā)病機制不清。近年來的研究表明，表觀遺傳機制異常在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。
　　Micr

2、oRNAs(miRNAs)為表觀遺傳調(diào)控重要機制之一。miRNAs是非編碼RNA分子中最大的一個亞型，長度約19-25個核苷酸。miRNA可通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)、編碼區(qū)或5'端非翻譯區(qū)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，抑制翻譯或引發(fā)mRNA降解，從而調(diào)控蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯(RISC)[1-3]。最近研究表明，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默調(diào)控至少60％的人類蛋白編碼基因[4]。miRNA在調(diào)節(jié)和促進免疫系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用

3、[5]，可以作為多種疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點[6]。目前已有很多關(guān)于研究miRNA的報道，如miR-155[7]、miR-326[8]、miR-23b[9]、miR-126[10]、miR-142-3p/5p[11]、miR-146a[5]、miR-182[12]、miR-150[13]和miR-124[14]等通過影響T、B細(xì)胞的功能，進而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。在人類多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、自身免

4、疫性糖尿病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA的異常表達(dá)。然而，miRNA在SLE的發(fā)病機制中的具體作用還需要進一步研究。
　　目前miR-1246只在人類和猿類基因組中被發(fā)現(xiàn)，在人類其編碼基因位于染色體2q31.1上，近期有研究報道m(xù)iR-1246異常表達(dá)與P53調(diào)控有關(guān)，從而參與唐氏綜合征及腫瘤的發(fā)病機理[10，15，16]。也有研究報道稱血清學(xué)檢測miR-1246可作為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[17]。然而關(guān)于

5、miR-1246在自身免疫疾病中的發(fā)病機制尚未有任何研究報道。本課題前期通過miRNA芯片技術(shù)研究比較11例SLE患者與11健康對照者B細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，miR-1246在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)降低。將樣本量擴大后進行real-time PCR驗證了miR-1246在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。同時我們也證實了miR-1246低表達(dá)與Akt異?；罨种芇53表達(dá)有關(guān)。而且我們證實了EBF1是miR-124

6、6靶基因。用miR-1246抑制劑處理健康對照組B細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)EBF1表達(dá)明顯上調(diào)，B細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生抗體增多。相反，過度表達(dá)miR-1246導(dǎo)致SLE患者B細(xì)胞中EBF1的表達(dá)水平下調(diào)，B細(xì)胞活性降低，抗體產(chǎn)生減少。同時我們還發(fā)現(xiàn)miR-1246通過調(diào)控EBF1的表達(dá)，使BCR信號通路AKT磷酸化水平發(fā)生改變，從而調(diào)控P53的表達(dá)水平，使miR-1246的表達(dá)進一步發(fā)生變化。通過這些研究揭示了miR-1246低表達(dá)可能是導(dǎo)致SLE

7、B細(xì)胞過度活化的重要分子機制，為尋找治療SLE有效的新生物學(xué)靶點提供了理論依據(jù)。
　　第一章 SLE患者B細(xì)胞MIR-1246表達(dá)與Akt信號調(diào)控
　　第一節(jié) SLE患者B細(xì)胞miR-1246、Akt、P53表達(dá)水平
　　目的:研究SLE患者B細(xì)胞MIR-1246表達(dá)是否異常？及其分子機制為何？
　　方法:
　　1.密度梯度離心分離30例活動性SLE患者、20例非活動性SLE患者及20例正常人外周血單個核細(xì)

8、胞，磁珠分離B細(xì)胞;
　　2.提取總RNA和總蛋白;
　　3.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測miR-1246及P53mRNA表達(dá)水平;
　　4.蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測Akt總蛋白及磷酸化水平、P53蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，SLE患者B細(xì)胞miR-1246明顯下調(diào)(p＜0.001)，P53 mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào)，Akt磷酸化水平明顯增高，差異均

9、有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。但Akt總蛋白水平無明顯差異(P＞0.05)。Akt磷酸化水平與P53蛋白表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)(P＜0.001)。P53 mRNA及蛋白表達(dá)水平與miR-1246表達(dá)水平成正相關(guān)(P＜0.05或P＜0.001)。
　　結(jié)論:SLE患者B細(xì)胞中MIR-1246低表達(dá)可能與Akt活化后抑制P53的表達(dá)，進而抑制miR-1246的表達(dá)有關(guān)。
　　第二節(jié)激活或抑制Akt信號通路對B細(xì)胞MI

10、R-1246表達(dá)的影響
　　目的:觀察激活或抑制Akt對MIR-1246及P53的表達(dá)影響
　　方法:
　　1.密度梯度離心分離三例正常人及三例活動性SLE患者外周血單個核細(xì)胞，磁珠分離B細(xì)胞;
　　2.培養(yǎng):將Akt激活劑(Akt activator)或陰性對照(Negativecontrol)加入正常人B細(xì)胞中培養(yǎng);將Akt抑制劑(Akt inhibitor)或陰性對照(Negative control)加入

11、SLE患者B細(xì)胞中培養(yǎng);
　　3.提取總RNA和總蛋白;
　　4.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測miRNA及P53mRNA表達(dá)水平;
　　5.蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測Akt總蛋白及磷酸化水平、P53蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.加入Akt激活劑的正常人B細(xì)胞，Akt總蛋白水平無明顯差異(P＞0.05)，Akt蛋白磷酸化水平升高，P53 mRNA及蛋白水平降低，

12、miR-1246表達(dá)下調(diào)，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.加入Akt抑制劑的SLE患者B細(xì)胞，Akt總蛋白水平無明顯差異(P＞0.05)，Akt磷酸化水平降低，P53 mRNA及蛋白水平升高，miR-1246表達(dá)升高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:Akt激活能抑制B細(xì)胞P53表達(dá)從而抑制B細(xì)胞miR-1246的表達(dá)。抑制Akt磷酸化能上調(diào)B細(xì)胞P53表達(dá)從而上調(diào)miR-1246的表達(dá)。

13、
　　第二章SLE患者B細(xì)胞miR-1246靶基因表達(dá)水平
　　第一節(jié) miR-1246靶基因的預(yù)測與驗證
　　目的:驗證Ebf1為miR-1246的靶基因。
　　方法:
　　1.運用Mirbase/Targetscans/PicTar等靶基因預(yù)測軟件查找miR-1246可能的靶基因，從中篩選出可能與SLE發(fā)病過程密切相關(guān)的基因作為候選靶基因，我們選擇Ebf1為miR-1246的潛在靶基因。
　　2.

14、構(gòu)建螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體:將包含Ebf1的3'-UTR區(qū)克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector(Ambion)載體編碼熒光素酶基因序列下游，構(gòu)建Ebf1野生型(Ebf1WT-luciferase)熒光素酶報告基因質(zhì)粒，同時采用點突變的方法使Ebf1-3'-UTR中miR-1246的結(jié)合位點發(fā)生堿基突變，構(gòu)建突變型(Ebf1Mut-luciferase)熒光素酶報告基因質(zhì)粒。
　　3.轉(zhuǎn)染:Ebf1W

15、T-luciferase和Ebf1Mut-luciferase與miR-1246模擬物(miR-1246 mimic)和陰性對照（Negative control）用電穿孔法瞬時共轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞。
　　4.轉(zhuǎn)染48小時后收集細(xì)胞，運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參照，檢測螢火蟲熒光素酶的活性。
　　結(jié)果:
　　1.通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)多個miR-1246的潛在靶基因，Ebf1基因為其中

16、之一;
　　2.在Jurkat細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-1246模擬物，可以抑制Ebf1野生型(Ebf1WT-luciferase)熒光素酶活性(p＜0.05)，而當(dāng)Ebf1-3'-UTR突變修飾后(Ebf1Mut-luciferase)，miR-1246不能抑制其活性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:Ebf1為miR-1246的靶基因，miR-1246通過作用于3，端UTR區(qū)抑制靶基因Ebf1表達(dá)。
　　第二節(jié) SLE患者B細(xì)

17、胞miR-1246靶基因Ebf1表達(dá)水平
　　目的:觀察miR-1246靶基因Ebf1在SLE患者B細(xì)胞的表達(dá)水平
　　方法:
　　1.密度梯度離心分離正常人20例、活動性SLE患者30例的外周血單個核細(xì)胞，磁珠分離B細(xì)胞;
　　2.試劑盒提取總蛋白;
　　3.蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測Ebf1蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　與健康對照組相比，SLE患者B細(xì)胞Ebf1蛋白表達(dá)水平

18、升高(P＜0.01)，且與miR-1246表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.82，P＜0.001)。
　　結(jié)論:miR-1246靶基因Ebf1在SLE患者B細(xì)胞表達(dá)增高，且與miR-1246表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　第三章miR-1246表達(dá)異常與自身免疫反應(yīng)
　　目的:研究抑制或過表達(dá)miR-1246表達(dá)對Ebf1、Akt信號通路及自身免疫反應(yīng)的影響
　　方法:
　　1.密度梯度離心分離三例正常人、三例活

19、動性SLE患者的外周血單個核細(xì)胞，磁珠分離B細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞;
　　2.轉(zhuǎn)染:miR-1246抑制物(miR-1246 inhibitor)或陰性對照(Negative control)用電穿孔法瞬時轉(zhuǎn)染至正常人B細(xì)胞。miR-1246mimic或陰性對照（Negative control）用電穿孔法瞬時轉(zhuǎn)染至SLE患者B細(xì)胞;
　　3.TB孵育ELISA方法檢測自身B細(xì)胞IgG抗體產(chǎn)生水平;
　　4.流式細(xì)胞儀檢

20、測B細(xì)胞CD40，CD80，CD86蛋白表達(dá);
　　5.試劑盒提取總RNA和總蛋白;
　　6.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測miRNA、P53mRNA，CD40mRNA，CD80mRNA，CD86 mRNA的表達(dá)水平;
　　7.蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測Akt總蛋白及磷酸化水平，Ebf1及P53蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染miR-1246抑制物的B細(xì)胞表現(xiàn)

21、為miR-1246水平降低;Ebf1蛋白水平增高;自身B細(xì)胞的IgG抗體產(chǎn)生水平增加;CD40mRNA，CD80mRNA，CD86mRNA及蛋白均表達(dá)升高; Akt蛋白磷酸化水平升高;P53mRNA及蛋白水平降低;差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。但Akt總蛋白水平無明顯差異(P＞0.05).
　　2.轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic的B細(xì)胞表現(xiàn)為miR-1246水平增高;Ebf1蛋白水平降低;自身B細(xì)胞的Ig

22、G抗體產(chǎn)生水平降低;CD40mRNA，CD80mRNA，CD86 mRNA及蛋白均表達(dá)降低;Akt蛋白磷酸化水平降低;P53mRNA及蛋白水平升高;差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。但Akt總蛋白水平無明顯差異(P＞0.05).
　　結(jié)論:抑制miR-1246表達(dá)可升高正常人B細(xì)胞Ebf1蛋白表達(dá)水平，促進Akt信號通路激活，使B細(xì)胞具有自身免疫反應(yīng)性。過表達(dá)miR-1246表達(dá)可降低SLE患者B細(xì)胞Ebf1蛋