雌二醇在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用.pdf

1、本文采用切除卵巢的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic erythematosus lupts，SLE)模型鼠作為研究對象，以減少內(nèi)源性雌激素的干擾，通過人工注射苯甲酸雌二醇控制體內(nèi)E2的水平，觀察其對SLE發(fā)生發(fā)展的影響。觀察了不同水平的E2對SLE模型小鼠腎臟局部芳香酶mRNA表達的影響，進一步探討E2可否通過調節(jié)芳香酶的活性影響SLE的病理過程。 實驗方法： 一、SLE小鼠模型的制備和脾細胞凋亡及相關調控機制的研究

2、 1、脾細胞懸液的制備無菌取Balb/c小鼠脾臟制備脾細胞懸液，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度為2×10<'6>/ml，加入ConA，使其終濃度為5μg/ml。將加有ConA的脾細胞懸液置37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12h后，收集活化脾細胞并以生理鹽水調節(jié)脾細胞濃度為2×10<'8>/ml，同樣條件制備未用ConA刺激的脾細胞懸液作為對照。 2、動物分組及處理取72只小鼠隨機分為3組，每組2

3、4只： (1)SLE模型誘導組(model induced group，MI組)取ConA刺激活化的脾細胞5×10<'7>/只皮下注射，每周1次，連續(xù)3次。 (2)脾細胞對照組(cell control grotlp，CC組)給正常小鼠在相同時間、相同部位注射相同劑量的未經(jīng)ConA活化的同系脾細胞懸液。 (3)正常對照組(normal control grollp，NC組)給正常小鼠在相同時間、相同部位注射相同體

4、積的生理鹽水。 3、SLE模型鼠的鑒定 (1)樣品的收集于初次免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每組分別取出6只小鼠，用乙醚麻醉后摘除眼球采血，析出血清用于自身抗體ANA和AHA的測定。無菌取出雙側腎臟，分為3部分，第1部分離體后立即置于液氮中，用于制備冰凍切片進行直接熒光抗體檢測；第2部分切取1mm<'3>腎皮質置于3％戊二醛固定液中固定，用作制備超薄切片進行透射電鏡觀察；第3部分腎組織置于10％甲醛中固

5、定，用于制備石蠟切片進行HE染色。 (2)SLE模型鼠外周血中ANA、AHA的測定采用ELISA法檢測，按試劑盒說明書進行。 (3)SLE模型鼠腎臟病理改變的觀察。 ①光學顯微鏡觀察腎臟形態(tài)學的變化：常規(guī)制備小鼠腎組織石蠟切片，HE染色，用中性樹脂封固，光學顯微鏡下觀察并對腎小球病理學改變的嚴重程度進行打分。 ②熒光顯微鏡觀察腎臟IgG類IC的沉積：采用直接免疫熒光法，簡述如下：無菌取小鼠腎臟進行冰凍切片

6、，滴加羊抗小鼠FITC-IgG抗體于組織切片上，置37℃孵育30min，在熒光顯微鏡下觀察腎小球內(nèi)有無IgG沉積及分布部位、熒光強度。 ③電子顯微鏡觀察腎臟超微結構的改變：腎臟經(jīng)3％戊二醛磷酸預固定、1％鋨酸后固定、812環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、電子染色后，透射電鏡觀察腎小球基底膜、足突的變化及有無電子致密物沉積。 4、SLE模型鼠脾細胞凋亡的檢測 于實驗第4wk，無菌取小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，PBS洗滌并調節(jié)

7、細胞密度為2×10<7>/ml，取細胞懸液進行涂片，4％多聚甲醛固定后采用Tunel試劑盒檢測細胞凋亡，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行操作，熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用NIS．Elements BR2．30圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞百分率。 5、SLE模型鼠脾細胞Bcl-2和NFkB的檢測 采用免疫細胞化學方法，簡述如下：脾細胞收集及細胞涂片固定同上(4、SLE模型鼠脾細胞凋亡的檢測)，3％H<,2>O<,2>去離子水3

8、7℃5min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加1：200稀釋的一抗(兔抗鼠Bcl-2和鼠抗鼠NF kB)50μl，4℃過夜，PBS洗滌后，再分別滴加相應的酶標二抗(抗兔和抗鼠)1滴，30℃ 25min，洗滌后，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照，采用圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞百分率。 二、E2對Balb/c小鼠SLE模型誘導的影響 1、動物分組及處理Balb/c近交系小鼠168只，隨機分為7組

9、，每組24只。 A組：假手術對照組，切除雙側卵巢周圍的兩小塊脂肪作對照；B組：手術對照組，進行雙側卵巢切除作對照；C組：假手術模型組，假手術后進行SLE模型誘導；D組：手術模型組，雙側卵巢切除后進行SLE模型誘導；E組：E2小劑量組；F組：E2中劑量組；G組：E2大劑量組。E組、F組和G組小鼠切除雙側卵巢后，進行SLE模型誘導，并且分別肌肉注射E2 0.1 μg/小鼠、1μg/小鼠和10 μg/小鼠，隔日1次，直至開始相應指標檢測。A、

10、B、C、D組小鼠隔日肌肉注射相當于E2容量的花生油作對照。 2、樣品的收集于初次細胞免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每組分別取出6只小鼠用乙醚麻醉，摘除眼球取血，析出血清，用于ANA、AHA及E2測定。無菌取腎臟，分為4部分，第1部分腎組織每100mg加入0.5ml PBS液體勻漿，離心后取上清，用于測定腎組織E2。第2部分取1mm<'3>腎皮質加入3％的戊二醛磷酸固定液中固定，用于電鏡觀察腎臟超微結構的改變。第

11、3部分迅速凍于液氮，后移至-70℃保存，用于制備冰凍切片進行直接熒光抗體法檢測IgG類IC的沉積。第4部分于10％甲醛中固定，進行石蠟切片HE染色。 實驗結果： 一、SLE小鼠模型的制備和脾細胞凋亡及相關調控機制的研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)MI組24只小鼠外周血中均出現(xiàn)ANA和AHA，腎臟發(fā)生病理學改變，而CC和NC組小鼠外周血中未檢出自身抗體，腎組織完好。具體檢測結果如下： 1、SLE模型鼠外周血中ANA和AHA水平的變化

12、MI組小鼠外周血中出現(xiàn)ANA和AHA，自身抗體自第1次接種活化脾細胞后第4wk出現(xiàn)，且逐漸升高，到第10wk開始下降。而CC和NC組小鼠外周血中中未測得ANA和AHA。 2、SLE模型鼠腎臟病理的改變 (1)光學顯微鏡下腎臟形態(tài)學的變化MI組小鼠出現(xiàn)腎小球腎炎的表現(xiàn)，炎性改變程度隨時間延長而加劇，而CC組和NC組小鼠腎小球結構清晰，無異常病理改變。 (2)熒光顯微鏡檢查IgG類IC沉積的變化腎臟冰凍切片直接熒光抗

13、體檢測發(fā)現(xiàn)MI組大多數(shù)腎小球內(nèi)都有被FITC著色的斑塊狀沉積物，可見腎小球毛細血管襻免疫復合物沉積，呈連續(xù)性熒光分布，隨著活化脾細胞免疫時間延長，可見腎臟冰凍切片熒光滴度增強。而CC組和NC組小鼠腎臟未見IgG類免疫復合物的沉積，直接熒光染色微弱、無特異性，腎小球輪廓不清。 (3)電子顯微鏡下超微結構的變化MI組小鼠腎小球濾孔膜融合，內(nèi)皮細胞脫落，系膜細胞插入基膜，基膜厚度彌漫不均，可見基膜區(qū)有電子致密物沉積。檢測發(fā)現(xiàn)MI組小鼠

14、第10wk腎臟超微結構改變最嚴重。CC組和NC組基底膜厚度均勻，濾過屏障結構完好，未見電子致密物沉積。 3、SLE模型鼠脾細胞凋亡的變化與NC組和CC組相比較，MI組初次免疫后第4wk，其脾細胞凋亡百分率(0.89±0.23)明顯降低。 4、SLE模型鼠脾細胞Bcl-2和NFKappaB表達的改變與NC組和CC組相比較，MI組脾細胞Bcl-2和NF kB的表達細胞百分率(分別為89.78±7.62和52.12±8.87)

15、明顯增高。 二、E2對Balb/c小鼠SLE模型誘導的影響。 1、SLE模型鼠外周血中及腎組織E2水平的變化B組外周血中E2水平明顯降低，與A組相比較差異顯著(P<0.01)。但B組外周血中E2隨著時間逐漸升高，第10wk與第4wk相比較有明顯差異(p<0.01)。C組和D組外周血中E2的水平分別高于A組和B組(P<0.01)，說明SLE炎癥狀態(tài)下，外周血中E2水平升高。E、F、G組相當于超過機體生理水平的3個劑量組，由

16、于激素在體內(nèi)的累積作用，無論血中，還是腎組織中E2均逐漸升高。3組外周血中E2水平在第4wk、第6wk、第8wk和第10wk兩兩差異均非常顯著(P<0.01)。小鼠腎組織E2的變化與外周血中E2水平的變化基本保持一致，但是腎組織E2明顯低于外周血中E2。 2、E2對SLE模型鼠外周血中ANA和AHA產(chǎn)生的影響經(jīng)同系活化脾細胞免疫的Balc/b小鼠外周血中均出現(xiàn)ANA和AHA，C組和D組自身抗體在第8wk達到最高峰，然后降低，符合

17、典型免疫應答的過程。而肌肉注射E2的E組、F組和G組到第10wk仍未見自身抗體的降低，可見E2是自身抗體產(chǎn)生的明顯的促進因素，這可能是女性育齡多發(fā)SLE的一個重要原因。A組及B組小鼠外周血中均未檢出ANA和AHA。 研究結論： 1、采用ConA活化的同系脾細胞成功地誘導了Balb/c小鼠SLE動物模型； 2、脾細胞凋亡抑制可能是ConA活化的同系脾細胞誘導Balb/c小鼠SLE的始動因素； 3、NF kB