轉(zhuǎn)錄因子E4BP4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的保護(hù)性作用及其分子機(jī)制.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種病變累及多系統(tǒng)、多器官，嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是T、B淋巴細(xì)胞異常過(guò)度活化，從而引發(fā)大量自身抗體的產(chǎn)生和免疫復(fù)合物的沉積。目前導(dǎo)致SLE發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確，但近年來(lái)研究表明，表觀遺傳機(jī)制在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。
　　表觀遺傳學(xué)修飾是一種不改變DNA序列，可逆的、可遺傳的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。其機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和microRNA的調(diào)控等

2、。近年來(lái)，學(xué)者們鑒定出了一系列組蛋白乙?；图谆揎椢稽c(diǎn)，不同修飾的組合形式，可以影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA相結(jié)合的能力，動(dòng)態(tài)的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄功能。目前關(guān)于SLE的表觀遺傳學(xué)研究多集中于DNA甲基化上，而關(guān)于組蛋白修飾在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用研究非常有限。
　　E4BP4也被稱為NFIL3，是一個(gè)具有堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)上升誘導(dǎo)E4BP4表達(dá)

3、上調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)E4BP4參與調(diào)節(jié)一些免疫細(xì)胞譜系的發(fā)育和功能，還可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞的IgE類轉(zhuǎn)換、T細(xì)胞極化反應(yīng)和細(xì)胞因子的表達(dá)。至目前為止，E4BP4在免疫失調(diào)和自身免疫性疾病的作用仍不清楚。本課題組前期在轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片中發(fā)現(xiàn)SLE患者和正常對(duì)照CD4+T細(xì)胞比較，E4BP4的轉(zhuǎn)錄活性增加。因此，我們推測(cè)E4BP4可能在SLE發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。
　　本研究將通過(guò)三個(gè)部分來(lái)證實(shí)E4BP4在SLE發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)理。第一

4、部分:檢測(cè)活動(dòng)性SLE患者，尤其是使用糖皮質(zhì)激素(GC)治療的患者中CD4+T細(xì)胞E4BP4表達(dá)。第二部分:研究E4BP4在SLE發(fā)病中的作用:(1)在用抗CD3/CD28抗體刺激的正常CD4+T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)E4BP4，檢測(cè)E4BP4對(duì)CD69、CD70、CD40L和CD11a等T細(xì)胞自身反應(yīng)性分子和自身抗體IgG產(chǎn)量的影響;(2)在SLE患者CD4+T細(xì)胞中抑制E4BP4基因表達(dá)，對(duì)T細(xì)胞自身反應(yīng)性和自身抗體IgG產(chǎn)量的影響。第三部分

5、:研究E4BP4調(diào)控CD4+T細(xì)胞中潛在靶基因CD40L表達(dá)機(jī)制:(1)通過(guò)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD40L可能是E4BP4調(diào)控的靶基因，檢測(cè)E4BP4與CD40L啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況，分析活動(dòng)性SLE患者CD4+T細(xì)胞CD40L表達(dá)水平與E4BP4蛋白表達(dá)的關(guān)系;(2)使用ChIP和Real-time PCR檢測(cè)E4BP4對(duì)CD40L啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙?；图谆揎椬饔?。
　　通過(guò)這些研究揭示E4BP4過(guò)表達(dá)在SLE發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用

6、及其對(duì)下游潛在靶基因表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為SLE的治療尋找新的有效途徑提供理論依據(jù)。
　　第一章 SLE患者CD4+T細(xì)胞E4BP4表達(dá)
　　目的:檢測(cè)SLE患者CD4+T細(xì)胞中E4BP4表達(dá)水平及其與疾病狀態(tài)的關(guān)系。
　　方法:采用密度梯度法分離正常對(duì)照、未使用糖皮質(zhì)激素(GC)治療SLE患者和使用GC治療患者各15例的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，Real-time PCR、Western blot的

7、方法分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)E4BP4的表達(dá)，并分析E4BP4與疾病活動(dòng)性評(píng)分(SLEDAI)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:和正常人比較，未使用和使用GC治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞E4BP4 mRNA水平均升高(未使用GC:P＜0.01，使用GC:P＜0.01)，其中使用GC治療組較未使用GC組E4BP4 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。和正常人比較，未使用和使用GC治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞E4BP4蛋白水平也均升高(

8、未使用GC:P＜0.05，使用GC:P＜0.01)，其中使用GC治療組較未使用GC組E4BP4蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。未使用GC和使用GC治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞E4BP4蛋白水平和SLEDAI評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（未使用GC:R=-0.771，P=0.001;使用GC:R=-0.607,P=0.0017)
　　結(jié)論:SLE患者CD4+T細(xì)胞中E4BP4表達(dá)明顯上調(diào)，糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)E4BP4在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)增

9、加，且E4BP4與疾病活動(dòng)性呈負(fù)關(guān)聯(lián)。
　　第二章E4BP4表達(dá)異常與自身免疫反應(yīng)關(guān)系的研究
　　第一節(jié)過(guò)表達(dá)E4BP4抑制CD4+T細(xì)胞活化及自身免疫反應(yīng)
　　目的:研究E4BP4過(guò)表達(dá)能否抑制抗CD3/CD28抗體誘導(dǎo)正常CD4+T細(xì)胞的活化及自身免疫反應(yīng)。
　　方法:采用密度梯度離心法分離3名正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞?？笴D3/CD28抗體活化CD4+T細(xì)胞后，

10、使用電穿孔法將pcDNA3.1-E4BP4表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)E4BP4蛋白表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染12小時(shí)CD69蛋白的表達(dá)情況，使用Real-time PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染36小時(shí)CD70、 CD40L、CD11a mRNA和蛋白的表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)自身B細(xì)胞IgG抗體表達(dá)水平。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染E4BP4表達(dá)質(zhì)粒至抗CD3/CD28抗體活化后

11、的CD4+T細(xì)胞后，E4BP4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，CD69蛋白表達(dá)明顯受到抑制(P＜0.01)， CD40L mRNA(P＜0.01)和CD40L蛋白(P＜0.05)表達(dá)均顯著下降，而CD70、CD11a mRNA和蛋白的表達(dá)則無(wú)差異，自身抗體IgG的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:E4BP4過(guò)表達(dá)抑制CD4+T細(xì)胞活化及自身免疫反應(yīng)。
　　第二節(jié)下調(diào)E4BP4表達(dá)加重SLE患者CD4+T細(xì)胞自身

12、免疫反應(yīng)
　　目的:探討抑制E4BP4表達(dá)是否導(dǎo)致SLE患者CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)加重。
　　方法:采用密度梯度離心法分離3名活動(dòng)性SLE患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)E4BP4的siRNA和對(duì)照siRNA，電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SLE患者的CD4+T細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)E4BP4蛋白表達(dá)水平，Real-timePCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD70、CD40L、C

13、D11a mRN和蛋白表達(dá)水平。ELISA法檢測(cè)自身B細(xì)胞IgG抗體表達(dá)水平。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染E4BP4-siRNA-3與對(duì)照siRANA相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞中E4BP4蛋白表達(dá)受到明顯抑制(P＜0.01)。抑制E4BP4表達(dá)的SLE患者CD4+T細(xì)胞CD40L mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.05)的表達(dá)量顯著增加，而CD70、CD11a mRNA和蛋白的表達(dá)則無(wú)差異。自身抗體IgG的表達(dá)水平明顯上升(P＜0.

14、01)。
　　結(jié)論:抑制SLE患者CD4+T細(xì)胞中E4BP4表達(dá)，可上調(diào)CD40L表達(dá)，加重CD4+T細(xì)胞自身反應(yīng)性，刺激B細(xì)胞活化產(chǎn)生更多的自身抗體。
　　第三章E4BP4調(diào)控CD4+T細(xì)胞CD40L表達(dá)及其分子機(jī)制
　　第一節(jié)CD4+T細(xì)胞中CD40L為E4BP4調(diào)控的靶基因的預(yù)測(cè)與鑒定
　　目的:研究CD4+T細(xì)胞中CD40L是否為E4BP4調(diào)控的靶基因。
　　方法:使用Mat-Inspector軟件

15、預(yù)測(cè)CD40L啟動(dòng)子區(qū)域（上游-2000bp到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)左右）是否有E4BP4的結(jié)合位點(diǎn)。采用密度梯度離心法分離3名正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，使用電穿孔法將pcDNA3.1-E4BP4表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞，使用免疫共沉淀ChIP-PCR檢測(cè)E4BP4是否與CD40L啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。使用Real-time PCR檢測(cè)第一部分標(biāo)本SLE患者CD4+T細(xì)胞中CD40L mRNA表

16、達(dá)水平并分析其與E4BP4相關(guān)性。
　　結(jié)果:Mat-Inspector軟件預(yù)測(cè)到CD40L啟動(dòng)子區(qū)域存在E4BP4的結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-PCR證實(shí)了E4BP4可與CD40L啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。未使用GC和使用GC治療的SLE患者CD4+T細(xì)胞和正常對(duì)照相比CD40L mRNA表達(dá)上調(diào)（未使用GC:P＜0.01，使用GC:P＜0.05），其中使用GC治療患者CD40L表達(dá)較未使用GC治療患者表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，且CD40L m

17、RNA水平與E4BP4蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(R=-0.758, P=0.001)。
　　結(jié)論:CD40L可能為E4BP4調(diào)控的靶基因。E4BP4可能通過(guò)抑制CD40L的表達(dá)使SLE患者CD4+T細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)降低。E4BP4在SLE發(fā)病中可能是一個(gè)保護(hù)性分子。
　　第二節(jié)E4BP4對(duì)CD40L啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙?；凹谆揎椀恼{(diào)控
　　目的:研究過(guò)表達(dá)E4BP4對(duì)CD4+T細(xì)胞的CD40L啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白修飾狀態(tài)的調(diào)

18、控作用。
　　方法:針對(duì)CD40L啟動(dòng)子區(qū)域可能的E4BP4結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，使用ChIP結(jié)合Real-time PCR檢測(cè)CD40L啟動(dòng)子區(qū)不同潛在結(jié)合靶點(diǎn)組蛋白H3乙?；图谆?。
　　結(jié)果:過(guò)表達(dá)E4BP4的CD4+T細(xì)胞CD40L啟動(dòng)子區(qū)潛在靶點(diǎn)2區(qū)域（啟動(dòng)子上游-200bp左右）組蛋白H3K9乙?；?P＜0.05)、H3K14乙酰化(P＜0.05)和H3K4三甲基化(P＜0.05)降低，而同區(qū)域的組蛋白H