rAAV-HIF-1α-siRNA聯(lián)合抗壞血酸治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:胰腺癌是一種常見的、高度惡性的消化道腫瘤。近幾十年的研究表明，其特點(diǎn)為早期診斷困難、手術(shù)切除率低、對(duì)放療和化療不甚敏感、預(yù)后極差。因此，積極尋求治療胰腺癌的新策略以提高療效是迫切需要解決的重要課題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是氧平衡調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞缺氧自適應(yīng)過程中起著中樞調(diào)節(jié)作用，并且廣泛影響著腫瘤細(xì)胞的糖代謝、增殖、凋亡和腫瘤的血管形成，使缺氧的組織細(xì)胞能保持氧穩(wěn)態(tài)以耐受缺氧狀態(tài)，而胰腺癌組織中

2、有高豐度的HIF-1α表達(dá)。因此，以HIF-1α為靶點(diǎn)有望成為治療胰腺癌的有效手段。腺相關(guān)病毒(AAV)載體，由于其安全性好、免疫原性低、可轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞以及介導(dǎo)外源基因的長期表達(dá)等特點(diǎn)，已經(jīng)成為基因治療領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)。基因治療的新技術(shù)——RNA干擾(RNAi)技術(shù)，即將靶基因序列同源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)，能達(dá)到基因敲除的效果。最近報(bào)道，抗壞血酸能通過加強(qiáng)二價(jià)鐵的利用來提高缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶

3、(HPH)的活性而加速HIF-1α蛋白的降解，使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧的能力下降，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。 因此，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建以重組腺相關(guān)病毒(rAAV)為載體和HIF-1α為靶基因的RNA干擾，聯(lián)合抗壞血酸，體外觀察其對(duì)厭氧培養(yǎng)條件下MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞HlF-1α蛋白和mRNA、VEGF的表達(dá)以及對(duì)MiaPaC2細(xì)胞增殖和凋亡的影響；同時(shí)，體內(nèi)觀察其對(duì)裸鼠皮下移植瘤的生長、增殖和血管形成能力的影響。通過初步探討抗

4、壞血酸和rAAV介導(dǎo)的HIF-1α-siRNA的抗癌機(jī)制，為今后尋找一條更加有效的基因、藥物等聯(lián)合治療胰腺癌途徑提供一些理論依據(jù)。 方法 1．rAAV介導(dǎo)的HIF-1α-siRNA 載體的構(gòu)建：提取人基因組DNA，PCR擴(kuò)增人H1啟動(dòng)子，插入載體質(zhì)粒pAAV-hrGFP 的 CMV啟動(dòng)子前方Mlu Ⅰ單克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成質(zhì)粒pAAV-H1-hrGFP，通過測(cè)序選擇人H1啟動(dòng)子片段正向插入的質(zhì)粒pAAV-H1-hrGFP；根

5、據(jù)HIF-1α的有效干擾位點(diǎn)，合成兩條分別為58bp互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，通過體外退火形成雙鏈，然后插入pAAV-H1-h-rGFOP的H1啟動(dòng)子尾部 Xba Ⅰ和Mun Ⅰ位點(diǎn)，構(gòu)建成質(zhì)粒pAAV-H1-siRNA-hrGFP；利用磷酸鈣共沉淀法將載體質(zhì)粒 pAAV-H1-siRNA-hrGFP 和輔助質(zhì)粒 pAAV-RC、pilelper 共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，“氯仿處理-PEG/NaCl沉淀一氯仿抽提”三步法濃縮和純化rAAV，SD

6、S-PAGE法檢測(cè)病毒的純度，電鏡觀察病毒形態(tài)和ELISA法測(cè)定病毒滴度。 2.體外實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)分為5組，分別是空白對(duì)照組、空載病毒組(rAAV-hrGFP)、干擾病毒組(rAAV-HlF-1α-siRNA)、抗壞血酸組(L-ascorbate)及聯(lián)合組(rAAV-HIF-1α-siRNA+L-ascorbate)。rAAV 均是以1×10<'6>v.p/cell 轉(zhuǎn)染MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞，加入的L-ascorbate終濃

7、度為25μM，在厭氧條件下培養(yǎng)，利用Real-Time PCR法、Western Blot 法、ELISA法、TUNEL 法、MTT法分別觀察各組胰腺癌細(xì)胞HIF-1α mRNA、HIF-1α蛋白和VEGF表達(dá)水平的變化以及各組細(xì)胞的凋亡和增殖情況。 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長期的MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞以5.0×10<'6>個(gè)接種于25只裸鼠背部皮下建立裸鼠腫瘤移植模型，同樣分上述五組，rAAV是以1.0×10<'11>v.p

8、進(jìn)行裸鼠右后腿脛骨前肌肌注，L-ascorbate 是以100mg/kg/day 灌胃，每3天測(cè)量一次腫瘤大小并繪制腫瘤生長曲線。30天后處死荷瘤裸鼠，取下腫瘤標(biāo)本，備常規(guī)HE染色和免疫組化染色，觀察各組腫瘤標(biāo)本HIF-1α、PCNA、CD34的表達(dá)并計(jì)數(shù)血管密度(MVD)。 結(jié)果 1.構(gòu)建的質(zhì)粒pAAV-H1-hrGFP，通過酶切以及測(cè)序鑒定結(jié)果正確；構(gòu)建的質(zhì)粒t9AAv-H1-siRNA-hrGFP，通過酶切及測(cè)序鑒

9、定結(jié)果也正確；包裝的rAAV經(jīng)電鏡檢測(cè)形態(tài)正常，SDS-PAGE 法檢測(cè)病毒的純度高，ELISA法檢測(cè)滴度達(dá)1.2×10<'12>v.p/ml。 2.體外實(shí)驗(yàn)：在厭氧培養(yǎng)條件下，Real-Time PCR 研究表明，rAAV-HIF-1α-siRNA 作用于MiaPaC2 人胰腺癌細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比，HIF-1α mRNA 的表達(dá)明顯下降，48h幾乎下降90％。而L-ascorbate對(duì)HIF-1αmRNA 的表達(dá)未發(fā)

10、現(xiàn)有任何影響。Western Blot 研究發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate 作用于MiaPaC2細(xì)胞24h后，與對(duì)照組比，HIF-1α蛋白明顯下降；在聯(lián)合組中，48h 下降更為顯著，幾乎達(dá)到高峰，超過90％的HTF-1α蛋白表達(dá)受抑。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate 都有抑制胰腺癌細(xì)胞分泌VEGF的作用，且48h的聯(lián)合組抑制VEGF的分泌作用更加顯著，而

11、rAAV-HIF-1α-siRNA抑制VEGF分泌的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于L-ascorbate，差異有顯著性(P<0.01)。通過TUNEL 細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate 都有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且 rAAV-HIF-1α-siRNA 促進(jìn)細(xì)胞凋亡最為明顯。MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖活性發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-aSCOrbate 都有抑制細(xì)胞增殖的作用，而聯(lián)合組抑制細(xì)胞增

12、殖的作用最強(qiáng)。然而，rAAV-hrGFP 對(duì)胰腺癌細(xì)胞 HIF-1α的表達(dá)、VEGF的分泌、增殖和凋亡，與對(duì)照組相比，未見明顯顯著性差異(P>0.05)。 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：從腫瘤的生長曲線圖中，我們發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組與空載病毒組之間未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異；抗壞血酸組在腫瘤生長的早、中期與空白對(duì)照組相比，差異有顯著性，而在晚期階段未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異；干擾病毒組以及聯(lián)合組與空白對(duì)照組相比，差異也有顯著性。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，空載病毒組與對(duì)照組

13、相比，HIF-1α、PCNA、CD34的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異(P>0.05)，而對(duì)照組與L-ascorbate組、干擾病毒組、聯(lián)合組相比，HIF-1α、PCNA、CD34的表達(dá)，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了rAAV介導(dǎo)的HIF-1α-siRNA 表達(dá)載體，為體內(nèi)外試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 2．體外實(shí)驗(yàn)表明，在厭氧培養(yǎng)條件下，rAAV-HIF-1α-siRNA有抑制MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞HIF

14、-1α mRNA 表達(dá)的作用，而L-aseorbate對(duì)HIF-1α mRNA的表達(dá)沒有影響。rAAV-HIF-1α-iRNA和L-ascorbate都可抑制MiaPaC2細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)和VEGF分泌的作用，并且其聯(lián)合作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其單獨(dú)作用。另外，rAAV-HIF-1α-siRNA 和 L-ascorbate都有促進(jìn)厭氧培養(yǎng)條件下MiaPaC2 人胰腺癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖的作用，且聯(lián)合作用更加顯著。 3．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明