新型K-,ATP-開放劑埃他卡林對(duì)原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β-,1-、PCNA mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary artery hypertension，PAH)是慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)展為慢性肺源性心臟病(Chronic cor pulmonale)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對(duì)PAH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病尚缺乏有效的治療手段。因此，對(duì)PAH形成機(jī)制的研究及其研發(fā)有效的防治藥物顯得尤為必要。 PAH患者肺血管阻力(Pulm

2、onary vascular resistance，PVR)和肺動(dòng)脈壓(Pulmonary aerial pressure，PAP)持續(xù)增高的主要原因是肺動(dòng)脈收縮和肺血管重構(gòu)，而肺血管重構(gòu)最大的特征是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary artery smooth muscle cells)增殖增加和(或)凋亡減少所致的肺動(dòng)脈中層增厚。近年來，肺血管平滑肌細(xì)胞鉀通道在肺動(dòng)脈重構(gòu)中的作用日益引起人們的關(guān)注。鉀通道功能下降，細(xì)胞內(nèi)K+外流減

3、少，細(xì)胞膜去極化，繼而引起細(xì)胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度(Cytoplasmic free Ca2+ concentration，[Ca2+]cyt)增加，刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)一步加重血管管壁重構(gòu)；另一方面，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀通道功能下降，細(xì)胞內(nèi)K+增多，凋亡性容積減少(Apoptotic volume decrease，AVD)作用減弱，胞漿胱門蛋白酶活性下降，細(xì)胞凋亡則減少，亦加重肺血管重構(gòu)。目前，肺血管平滑肌細(xì)胞鉀通道主要分為以

4、下四類：(1)電壓依賴性鉀(Kv)通道，(2)Ca2+激活性鉀(KCa)通道，(3)二孔鉀(K2P)通道，(4)內(nèi)向整流性鉀(KIR)通道。其中ATP敏感性鉀(KATP)通道是一類內(nèi)向整流性鉀通道，其活性受胞內(nèi)ADP/ATP調(diào)控，因此，KATP通道將細(xì)胞代謝和膜電位相偶聯(lián)，已經(jīng)成為研發(fā)新型治療PAH藥物的重要靶標(biāo)。 埃他卡林(Iptakalim，IPT)是我國(guó)自行設(shè)計(jì)、合成的新型選擇性KATP開放劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IPT

5、不僅降低大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓，逆轉(zhuǎn)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈重構(gòu)和右心室肥厚；還抑制內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)誘導(dǎo)的兔、人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[Ca2+]Cyt曾加和細(xì)胞增殖。 近年研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factorbeta-1，TGF-β1)和增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是肺動(dòng)脈重構(gòu)的重要細(xì)胞因子。并且本課

6、題研究亦發(fā)現(xiàn)，IPT能抑制大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1和PCNA表達(dá)。然而在原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，IPT對(duì)TGF-β1、PCNA表達(dá)是否有作用，尚需進(jìn)一步研究。 ET-1是導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、肺動(dòng)脈重構(gòu)的重要活性物質(zhì)。本文分別以ET-1和缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞，研究IPT耐人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1和PCNA表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討KATP通道調(diào)控肺動(dòng)脈重構(gòu)的作用機(jī)制。 第一部分

7、：新型KATP開放劑埃他卡林對(duì)ET-1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1、PCNA mRNA表達(dá)的影響 目的:觀察新型KATP開放劑埃他卡林(IPT)對(duì)ET-1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1和PCNA mRNA表達(dá)的影響。 方法:分離3～4級(jí)人肺小動(dòng)脈，按照組織貼塊法原代培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RQ-RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)TGF-β1和PCNA mRNA表達(dá)變化。

8、 結(jié)果:ET-1(10-5 mol·L-1)誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1、PCNA mRNA表達(dá)均增加；在相同條件下，加入ET-1(10-5 mol·L-1)的同時(shí)，分別在培養(yǎng)液中加入IPT10-7、10-6、10-5 mol·L-1，TGF-β1和PCNA mRNA表達(dá)分別呈濃度依賴性地下降；加入ET-1(10-5 mol·L-1)、IPT(10-5 mol·L-1)前30min，預(yù)先加入特異性KATP才吉抗劑格列本脲(G