HIF-1a調(diào)控VEGF對(duì)離體原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景:氧感受器:據(jù)知低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是細(xì)胞適應(yīng)低氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)也起十分重要的作用,它由氧敏感的α亞基(HIF-1α)和在核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的β亞基(HIF-1β)組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α作為是功能性亞基,可以調(diào)控100多種涉及低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)與存活的靶基因的表達(dá),從而在低氧應(yīng)答反應(yīng)中起核心作用,因而也稱為是最新一種的氧感受器。是低氧性肺血管重塑(HPSR)形成中調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的“分子

2、開關(guān)”。低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶(PHD1)是一種可以使HIF-1α脯氨酸殘基羥基化并調(diào)節(jié)其對(duì)氧穩(wěn)定性的重要的關(guān)鍵性酶;低氧誘導(dǎo)因子抑制因子(FIH)是調(diào)節(jié)HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活活性的另外一種關(guān)鍵酶。它們通過氧敏感的方式調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子活性及其表達(dá)。
　　目的:體外原代培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs),研究低氧下對(duì)大鼠PASMCs增殖的影響以及HIF-1α、PHD1、FIH、及HIF-1α靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在

3、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)變化的規(guī)律及相互關(guān)系;觀察HIF-1a基因過表達(dá)和沉默對(duì)PASMC中VEGF的表達(dá)的影響,為HPH發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)共分兩部分。第一部分,將SD大鼠消毒后剖開胸腹腔,無菌下取出心肺組織,然后分離出肺動(dòng)脈段,分離大鼠肺動(dòng)脈中膜層,用組織塊貼壁法培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、普通免疫組織化學(xué)法(SP法)和免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。然后將體外培養(yǎng)的大鼠 PASMCs,設(shè)計(jì)常氧組、低氧組

4、H2,H6,H12,H24。用四唑鹽(MTT)比色法測(cè)各組PASMCs增殖。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α、PHD1、FIH、VEGFmRNA表達(dá)水平,Western blotting法檢測(cè)HIF-1α、PHD1、FIH、VEGF的蛋白表達(dá)水平。第二部分,將HIF-1a基因轉(zhuǎn)染在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)中,將細(xì)胞

5、分為過表達(dá) HIF-1α組、對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)和沉默 HIF-1α組。經(jīng)常氧和低氧處理后分別用Western blotting法檢測(cè)HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)在不使用顯微技術(shù)情況下,用組織貼塊法成功培養(yǎng)大鼠PASMCs,得到穩(wěn)定生長、純度高的PASMCs,且培養(yǎng)與純化可以同時(shí)進(jìn)行,可獲得穩(wěn)定傳代的細(xì)胞。
　　(2)采用MTT法發(fā)現(xiàn),低氧2小時(shí)后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞明顯增殖,低氧24小時(shí)后細(xì)胞增殖達(dá)高

6、峰,此后增殖稍下降。HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白在常氧組表達(dá)陽性,低氧2小時(shí)后表達(dá)明顯增高,低氧6小時(shí)后達(dá)高峰,此后表達(dá)稍下降。PHD1 mRNA和蛋白在常氧組均呈陽性表達(dá),在低氧后表達(dá)下降。FIH mRNA和蛋白在常氧組均呈陽性表達(dá),在低氧后表達(dá)下降。VEGF mRNA和蛋白在對(duì)照組表達(dá)少量,低氧2小時(shí)后表達(dá)升高,低氧12小時(shí)后達(dá)高峰。
　　(3)在常氧下siRNA成功沉默HIF-1a基因后(siRNA-HIF-1a組

7、),PASMCs中HIF-1a和VEGF蛋白表達(dá)明顯減少,對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)表達(dá)較siRNA-HIF-1a組增多,過表達(dá)HIF-1a組HIF-1a蛋白表達(dá)明顯增加;在低氧下,siRNA-HIF-1a組HIF-1A和VEGF蛋白僅少量表達(dá),對(duì)照組開始增加,過表達(dá)組明顯增加,且低氧下各組HIF-1a和VEGF蛋白表達(dá)較常氧下各組均高。
　　(4)直線相關(guān)分析結(jié)果表明:在低氧大鼠肺肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HIF-1αmRNA及蛋白與VEGF m

8、RNA、VEGF蛋白均呈正相關(guān)。HIF-1α、VEGF蛋白與平滑肌細(xì)胞增殖正相關(guān)。FIH、PHD1mRNA及蛋白與VEGF mRNA、VEGF蛋白均呈負(fù)相關(guān)。FIH、PHD1蛋白及mRNA與HIF-1a mRNA、HIF-1a蛋白均呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)低氧能促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的低氧性增殖。(2)低氧可誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HIF-1a的表達(dá)。(3)HIF-1α、VEGF均參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖過程,HIF-1α可能以轉(zhuǎn)