K-ATP通道開放劑埃他卡林對C57B1-6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生的影響.pdf

1、K-ATP通道開放劑埃他卡林對C57B1/6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生的影響神經(jīng)再生(neurogenesis)是指神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)生成功能性神經(jīng)元的過程，包括神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、成熟及向神經(jīng)回路中整合等多個步驟。在絕大多數(shù)成年哺乳動物(包括人類)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system CNS)中，神經(jīng)再生主要集中于被稱為神經(jīng)再生區(qū)的側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subveilcricul

2、ar zone，SVZ)和海馬齒狀回亞顆粒細(xì)胞區(qū)(subgranular zone，SGZ)，但病理狀態(tài)下非神經(jīng)再生區(qū)也顯示出不同程度的神經(jīng)再生能力。成年神經(jīng)再生對中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持具有重要意義。研究顯示多種神經(jīng)退行性疾病及精神類疾病發(fā)病過程中均伴有成年神經(jīng)再生的異常。作用于神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)因素，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生，將成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中促進(jìn)組織修復(fù)和功能重建的新策略。目前，神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)機制尚不明確，研究、揭示內(nèi)源性神經(jīng)再生的

3、調(diào)節(jié)靶點、尋找調(diào)制神經(jīng)再生的藥物是當(dāng)今生命科學(xué)研究的難點和熱點。 埃他卡林(iptakalim，IPT)是由我國學(xué)者自行設(shè)計、合成的脂肪仲胺類小分子化合物。包括電生理學(xué)、藥理學(xué)研究及受體結(jié)合實驗在內(nèi)的系列研究已確認(rèn)其為新型ATP敏感性鉀通道(ATP sensitivepotassium channel，K-ATP通道)開放劑(K-ATP cllannel opener,KCO)。與現(xiàn)有的KCO相比，IPT易透過血腦屏障，外周副作

4、用少，因此具有實際研發(fā)價值。本實驗室前期研究已證實：IPT通過降低谷氨酸(glutamate，Glu)所介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)炎性因子的釋放等環(huán)節(jié)，不僅在急性缺血缺氧、神經(jīng)毒素致病理損傷等多種病理過程的早期對神經(jīng)元具有確切的保護作用，而且在損傷后的神經(jīng)炎性反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡過程中亦具有重要的調(diào)節(jié)作用。然而，IPT是否在神經(jīng)損傷后期即損傷后的修復(fù)和再生過程中同樣具有重要的調(diào)節(jié)作用呢?這是本課題的主要研究內(nèi)容。此外，神

5、經(jīng)干細(xì)胞是否表達(dá)K-ATP通道、其亞基構(gòu)成如何?目前均未見文獻(xiàn)報道。 在前期實驗發(fā)現(xiàn)IPT具有確切的神經(jīng)保護作用基礎(chǔ)上，本文工作應(yīng)用慢性溫和應(yīng)激(chronic mild stress，CMS)模型、以氟西汀作為陽性對照藥，進(jìn)一步研究IPT對正常狀態(tài)及CMS模型C5781/6J成年鼠海馬神經(jīng)再生的影響及其作用機制，并應(yīng)用Kir6.2基因敲除模式動物確定IPT作用的亞基選擇性。研究結(jié)果為將IPT發(fā)展成為靶向于調(diào)制神經(jīng)再生的藥物提供

6、理論依據(jù)。 目的：在研究C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞K-ATP通道的表達(dá)及其亞基組成的基礎(chǔ)上，探討、闡明K-ATP通道開放劑IPT對正常狀態(tài)及CMS模型C5781/6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生的影響及作用機制；應(yīng)用Kir6.2基因敲除鼠，進(jìn)一步確定IPT作用的Kir亞基選擇性。 方法：1)Western-blot及RT-PCR法鑒定原代培養(yǎng)的C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞上K-ATP通道的表達(dá)及亞基組成；2)[<'3>

7、H]-脫氧胸腺嘧啶([<'3>H]-TdR)摻入法研究IPT對原代培養(yǎng)的C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響；3)連續(xù)4周給予正常狀態(tài)和CMS模型C5781/6J成年鼠IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)，通過生理狀態(tài)評分、體重變化及懸尾實驗等行為學(xué)研究IPT對動物抑郁樣癥狀的改善情況；應(yīng)用5-溴脫氧尿核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記新生細(xì)胞；應(yīng)用免疫熒光雙染法檢測BrdU陽性

8、細(xì)胞向神經(jīng)元(NeuN)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)分化；Westem-blot法檢測ERK1/2-CREB信號通路磷酸化水平；5)連續(xù)4周給予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)，比較Kir6.2<'+/+>和Kir6.2<'-/->小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的差異，以確定IPT促神經(jīng)再生作用的亞基選擇性。 結(jié)果：1)C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)Kir6.1亞基組成的K-ATP通道，不表達(dá)Kir6.2亞

9、基；2)與對照組相比，IPT(1、10、100μM)均能顯著促進(jìn)原代培養(yǎng)的C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖，分別增加32％、50％和38％；3)連續(xù)4周給予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)顯著促進(jìn)正常狀態(tài)C5781/6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，與對照組相比增加了32％；連續(xù)4周給予IPT(10mg·kg<'-1>·day<'-1>)能夠逆轉(zhuǎn)CMS對成年鼠SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的抑制，并對動物抑郁樣癥狀有顯著

10、的改善作用；慢性給予IPT對新生細(xì)胞的存活率及其向神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞分化的分化率無顯著影響；4)連續(xù)給予IPT(10 mg·kg<'-1>·day<'-1>)4周顯著上調(diào)小鼠海馬區(qū)ERK1/2和cREB磷酸化水平，與對照組相比分別增加了53％和52％；5)Kir6.2基因敲除不影響IPT對C5781/6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用。結(jié)論：C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Kir6.1亞基組成的K-ATP通道，不表達(dá)Kir6.2亞

11、基；IPT通過作用于Kir6.1亞基組成的K-ATP通道促進(jìn)正常狀態(tài)C57B1/6J成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生，并逆轉(zhuǎn)CMS對成年鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生的抑制，其作用機制與激活ERK1/2-CREB信號通路相關(guān)。 本文工作的主要創(chuàng)新之處在于： 1、發(fā)現(xiàn)C5781/6J成年鼠神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)有Kir6.1亞基組成的K-ATP通道。 2、闡明IPT開放Kir6.1亞基組成的K-ATP通道促進(jìn)神經(jīng)再生，作用機制與激活ERK1/2-C