中藥小復(fù)方“松友飲”通過下調(diào)分化抑制因子1(ID1)抑制肝癌“干性”提高肝癌對(duì)化療敏感性研究.pdf

1、研究背景：
　　肝細(xì)胞性肝癌（以下簡稱肝癌）在全球的發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率已居于惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，死亡率居第三位。手術(shù)切除、局部消融對(duì)于早期肝癌可獲得50-60％的5年生存率。然而，由于肝癌病人或因合并嚴(yán)重的肝硬化，或診斷時(shí)已經(jīng)存在肝內(nèi)的轉(zhuǎn)移，無法接受手術(shù)切除及局部消融等根治性治療方法。因此超過70％的肝癌需要接受非根治性的治療方法，如肝動(dòng)脈栓塞化療、索拉非尼治療或系統(tǒng)性化療。然而，無論是局部的肝動(dòng)脈栓塞化療，或者系統(tǒng)性

2、的化療，治療肝癌的主要困難是有效率低，即便是治療有效的患者，多數(shù)仍因肝癌的進(jìn)展或者轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療的失敗。而治療失敗的主要原因是當(dāng)前治療方案雖然可造成肝癌組織細(xì)胞的壞死，但難以完全殺滅肝癌干細(xì)胞。而且已有的研究，包括我們課題組的前期研究確已證明，化療可引起殘余肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的惡化，包括上皮細(xì)胞間質(zhì)化改變的發(fā)生。因此，進(jìn)一步研究當(dāng)前治療存在的問題，以及通過適當(dāng)?shù)母深A(yù)提高現(xiàn)有的治療方法的效果，無疑對(duì)提高肝癌患者治療效果，改善肝癌患者的預(yù)后

3、有重要的意義。
　　方法：選用人肝癌細(xì)胞株MHCC97H（高轉(zhuǎn)移潛能）和Hep3B（低轉(zhuǎn)移潛能），梯度濃度奧沙利鉑序貫培養(yǎng)細(xì)胞株，使肝癌細(xì)胞株獲得耐受奧沙利鉑的特性并可穩(wěn)定生長，獲取細(xì)胞株并命名為MHCC97H-OXA和Hep3B-OXA，檢測(cè)該細(xì)胞“干性”(stemness)相關(guān)特征及標(biāo)志物變化。對(duì)奧沙利鉑耐藥的細(xì)胞株及母代細(xì)胞株經(jīng)裸鼠肝癌原位成瘤，尾靜脈注射奧沙利鉑，比較觀察腫瘤大小、裸鼠體重及肺轉(zhuǎn)移情況。為了研究化療處理后對(duì)

4、肝癌成瘤能力的影響，先裸鼠肝癌皮下成瘤經(jīng)過化療后的肝癌組織裸鼠再經(jīng)肝臟原位接種，比較化療后腫瘤大小、肺轉(zhuǎn)移、耐藥性的改變等“松友飲”過濾除菌，調(diào)整濃度至2mg/ml培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株MHCC97H和Hep3B，4周后獲取穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞株并命名為MHCC97H-SYY和Hep3B-SYY，檢測(cè)細(xì)胞“干性“相關(guān)特征及EMT、CSC指標(biāo)變化。“松友飲”聯(lián)合奧沙利鉑治療裸鼠原位肝癌，觀察腫瘤大小、肺轉(zhuǎn)移;全基因組芯片篩選奧沙利鉑治療組和對(duì)照組肝癌皮

5、下瘤差異基因，免疫組化和westernblot進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)在松友飲治療后的組織和細(xì)胞株中進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建慢病毒干擾/過表達(dá)目基因的穩(wěn)定細(xì)胞株，進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　結(jié)果：奧沙利鉑處理后的肝癌細(xì)胞株表現(xiàn)為凋亡數(shù)增加、增值速度降低、侵襲能力增強(qiáng)、克隆形成能力增強(qiáng)、CSC比例增加且呈EMT改變;裸鼠原位成瘤，尾靜脈注射奧沙利鉑5周后裸鼠體重下降(P=0.0296)，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)增加(P=0.0124)。經(jīng)奧沙利鉑治療后的肝癌組織再接種原位

6、，同樣發(fā)現(xiàn)成瘤能力增強(qiáng)(P=0.046)，肺轉(zhuǎn)移增加(P=0.0013)，耐藥性增加和肝內(nèi)播散增加;“松友飲”培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株其中CSC比例下降，呈MET改變，對(duì)奧沙利鉑敏感性增加，克隆形成能力降低。裸鼠原位成瘤后“松友飲”聯(lián)合奧沙利鉑治療組較單用奧沙利鉑組瘤體明顯縮小(P=0.0069)，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)也明顯減少(P=0.014);全基因組芯片及免疫組化提示奧沙利鉑處理過后的肝癌皮下瘤組織中ID1明顯增加，而“松友飲”處理過的肝癌組織及

7、細(xì)胞株則表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步構(gòu)建ID過表達(dá)和干擾的細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)ID1慢病毒干擾穩(wěn)定株P(guān)LVT750侵襲能力減弱(P=0.0116)，對(duì)奧沙利鉑敏感性增加(P=0.0023)，成瘤能力也明顯降低，而ID1過表達(dá)細(xì)胞株P(guān)SB796侵襲能力增加(P=0.0012)，對(duì)奧沙利鉑敏感性減弱(P=0.0121)，成瘤能力明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1.奧沙利鉑治療后的肝癌“干性”增強(qiáng)。
　　2.“松友飲”能夠降低肝癌的“干性”

8、，同樣也可降低奧沙利鉑化療后肝癌增強(qiáng)的“干性”。
　　3.下調(diào)分化抑制因子(ID1)是“松友飲”降低肝癌“干性”的關(guān)鍵作用機(jī)制之一。
　　應(yīng)用價(jià)值
　　1.明確了化療后殘余肝癌細(xì)胞和組織干細(xì)胞比例增加、“干性”增強(qiáng)，有助于指導(dǎo)臨床對(duì)靶向肝癌干細(xì)胞藥物的探索，從而達(dá)到降低肝癌化療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。
　　2.中藥小復(fù)方“松友飲”能夠減少化療后殘余肝癌細(xì)胞和組織的干細(xì)胞比例，降低其“干性”，彌補(bǔ)當(dāng)前療法無法除根（干細(xì)胞）的

9、缺陷，為傳統(tǒng)中藥治療肝癌提供理論依據(jù)。
　　3.中藥小復(fù)方“松友飲”聯(lián)合化療藥奧沙利鉑可作為臨床輔助治療肝癌的一種方式。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.首次用肝癌干細(xì)胞的理論解釋了傳統(tǒng)中藥小復(fù)方“松友飲”的作用機(jī)理，為中藥臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
　　2.首次報(bào)道中藥小復(fù)方“松友飲”可減少肝癌組織細(xì)胞中干細(xì)胞的比例、降低其“干性”，增加奧沙利鉑治療肝癌的敏感性。
　　3.首次報(bào)道了中藥復(fù)方“松友飲”可通過下調(diào)分化抑