中藥小復方“松友飲”通過調(diào)控肝星狀細胞抑制有纖維化背景肝癌的惡性潛能.pdf

1、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌），是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，且具很高復發(fā)率和死亡率。由于其侵襲性強和發(fā)展迅速，大多數(shù)肝癌患者在確診時已近晚期，失去了手術根治機會。因此，超過70％的肝癌需要接受非根治性的治療方法，如肝動脈栓塞化療、索拉非尼治療或系統(tǒng)性化療，但收效甚微。尤為甚者，在我國肝癌多合并肝纖維化、肝硬化背景。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化、肝硬化、肝癌都是

2、肝實質(zhì)細胞與肝間質(zhì)細胞相互作用的結果，這其中星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，作為肝間質(zhì)細胞的主要組成，與炎癥關系密切，受多種因素刺激，增殖活化，表達α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)并大量合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，成為肝纖維化等慢性肝病細胞外基質(zhì)和膠原產(chǎn)生的主要細胞來源，被認為是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。而伴隨著HSC的激活、增殖

3、，肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)的形成，以及與ECM共同構成的組織微環(huán)境可能促成了肝干細胞或肝細胞向肝癌細胞的轉化，并在肝癌的進一步增殖、侵襲、轉移過程中發(fā)揮作用。如此，肝癌細胞和星狀細胞間一定存在著密切的聯(lián)系，而這種聯(lián)系也許可成為肝癌治療的又一靶點，即通過調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境中的星狀細胞進而抑制肝癌。
　　中醫(yī)藥抗纖維化和腫瘤治療歷史悠久，為我們發(fā)展有中國特色的抗肝癌研究提供了一條可探索之路。依托前人的經(jīng)驗和前期的

4、研究基礎，我們應用本所研制的含黃芪、丹參、山楂、鱉甲、枸杞五味成份的中藥小復方“松友飲”，對有肝纖維化背景的裸鼠原位移植瘤施以干預，并重點通過研究其對于肝癌纖維化微環(huán)境中的星狀細胞的作用，最終找到“松友飲”抑制有肝纖維化背景肝癌惡性潛能的可能機制。
　　目的:應用中藥小復方“松友飲”(SYY)對有肝纖維化背景荷人肝癌裸鼠進行干預，試圖證明“松友飲”通過對肝纖維化微環(huán)境中的肝星狀細胞(HSC)發(fā)揮影響而抑制肝癌的惡性潛能，并進一步探

5、索其可能的作用機制。
　　方法:1、5-6周齡裸鼠30只，皮下注射四氯化碳(四氯化碳/橄欖油:50∶50)，每周一次，每只裸鼠5μl/g，自注射第四周末開始，每隔兩周頸椎脫臼法處死6只裸鼠，共計10周，動態(tài)觀察肝臟大體標本變化，利用組織病理切片和免疫組化技術，對裸鼠纖維化程度進行鑒定。2、20只裸鼠隨機平均分為4組，原位接種高轉移人肝癌細胞HCCLM3皮下瘤組織塊，原位種瘤后3天，其中兩組開始予以四氯化碳皮下注射（5μ l/g/只

6、/周），另外兩組予以同等劑量的生理鹽水處理，同時，在上述兩種處理方法下各有一組開始自由飲用SYY（2g/Kg/日），6周后全部裸鼠脫頸處死，觀察肝臟變化及成瘤情況，提取肝組織作病理檢查;5-6周齡裸鼠45只，隨機均分為9組，4組作為實驗組，4組作為對照組，1組作為觀察組，實驗組每組裸鼠皮下分別注射不同數(shù)量級的高轉移人肝癌細胞HCCLM3(0.1ml)和人肝星狀細胞LX2(0.1ml，1×105)的混合細胞共計0.2ml，對照組每組皮下注

7、射相應數(shù)量級的HCCLM3細胞(0.2ml)而不混合LX2，最后1組在皮下單獨注射LX2細胞2×105(0.2ml)，12周后全部裸鼠脫頸處死，觀察皮下成瘤情況;5-6周齡裸鼠15只，隨機平均分成3組，取兩組，每只裸鼠皮下注射1×106LX2(0.1ml)和1×105HCCLM3(0.1ml)的混合細胞，其中一組作為實驗組開始自由飲用SYY（2g/Kg/日），另一組作為對照組正常飲食，第三組裸鼠皮下注射1×106(0.2ml) LX2細

8、胞，正常飲食，6周后所有裸鼠脫頸處死，觀察皮下成瘤、肺轉移，提取肝、肺組織作病理檢查。3、利用CCK8實驗和乳酸脫氫酶釋放實驗(LDH)檢測“松友飲”對LX2的增殖抑制和毒性作用;取濃度(8mg/ml)SYY加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)LX2細胞48h，取其上清作為條件培養(yǎng)基再分別培養(yǎng)HCCLM3、Hep3B細胞，并以此作為實驗組，兩組細胞的對照組則采用正常培養(yǎng)LX2培養(yǎng)基上清作為條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時，再取加入了同樣濃度的SYY的正常培養(yǎng)基培

9、養(yǎng)上述兩種細胞，同樣設立正常培養(yǎng)基作為對照組，以上各組細胞再分別進行克隆形成實驗、CCK8實驗和transwell侵襲實驗;抽提經(jīng)SYY處理過48h的LX2細胞的總RNA作為實驗組，對照組為正常培養(yǎng)狀態(tài)下的LX2細胞的總RNA，進行全基因組表達譜芯片分析，得到差異基因中的核心調(diào)控基因及與之相關的信號通路;利用蛋白免疫印跡(Western-blot)對核心基因編碼的蛋白及調(diào)控該信號通路的關鍵蛋白進行驗證;利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa)

10、對兩組細胞分泌上清中的相關蛋白進行驗證。4、應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、應用四氯化碳皮下間斷注射法成功建立裸鼠肝纖維化模型;免疫組化顯示作為肝纖維化過程中心環(huán)節(jié)的星狀細胞，其活化階段的標志性蛋白“α-SMA”的表達強度與肝纖維化進展正相關。2、四氯化碳誘導肝纖維背景下的肝癌瘤重大于正常肝臟背景下的原位移植瘤，每日自由飲用2g/Kg劑量的SYY對于肝纖維化背景下裸鼠的肝癌生長

11、有明顯抑制作用，同樣劑量的SYY對于正常肝臟背景下的肝癌生長無明顯抑制作用，免疫組化（α-SMA染色）提示:肝纖維化背景下的裸鼠肝癌及癌周存在大量活化的星狀細胞;細胞數(shù)量小于1×105的HCCLM3腫瘤細胞不能單獨皮下成瘤，細胞數(shù)量小于1×105的HCCLM3腫瘤細胞在混合了同樣數(shù)量的LX2細胞后，可以皮下成瘤，而相同數(shù)量的LX2細胞不能單獨成瘤;自由飲用SYY對于接種了HCCLM3和LX2混合細胞的裸鼠皮下瘤的生長有明顯抑制作用，單獨

12、接種同樣數(shù)量HCCLM3腫瘤細胞的裸鼠不能皮下成瘤，裸鼠混合皮下瘤組織切片HE和Sirius染色提示:兩組皮下瘤內(nèi)均存在大量的纖維細胞和膠原纖維組織，自由飲用SYY的裸鼠混合瘤組織內(nèi)細胞增殖核抗原(proliferatingcell nuclear antigen，PCNA)和α-SMA陽性染色累積光密度值均明顯小于對照組，兩組皮下瘤組織內(nèi)PCNA和a-SMA免疫熒光雙染也呈現(xiàn)同樣的結果，SYY對于裸鼠混合皮下瘤的肺轉移也有明顯抑制作用

13、。3、CCK8實驗和乳酸脫氫酶釋放實驗顯示“松友飲”(8mg/ml)對于人肝星狀細胞LX2沒有增殖抑制和急性毒性作用;經(jīng)SYY處理過LX2的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HCCLM3和Hep3B兩種腫瘤細胞均提示能夠減弱其克隆形成能力，并明顯弱化了兩種細胞的增殖能力和侵襲能力，而經(jīng)SYY直接處理的兩種腫瘤細胞在上述三個實驗中與對照組相比較沒有明顯差異;全基因組芯片顯示，與對照組相比較，經(jīng)SYY處理過的LX2細胞中:上調(diào)的基因有1205個，下調(diào)的基因有1

14、323個，這其中與細胞增殖、凋亡、生長、分化相關的一些基因表達明顯下調(diào)（如:PIK3CD，AKT，IGF1R，TGF-β），并由此篩選出發(fā)揮關鍵作用的信號通路PI3K/AKT; Western-blot結果證實:經(jīng)SYY處理后的HSC，其細胞內(nèi)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的一些關鍵蛋白的表達明顯下調(diào);Elisa結果顯示:經(jīng)SYY處理后HSC所分泌的上清中，影響肝癌增殖，分化，侵襲的一些主要蛋白的表達受PI3K/AKT信號通路的下調(diào)明顯降

15、低。
　　結論:1、應用四氯化碳皮下間斷注射法，可以成功建立實驗性裸鼠肝纖維化動物模型;2、肝纖維化過程中星狀細胞的活化程度與纖維化的進展正相關;3、“松友飲”(SYY)對于肝纖維化背景下肝癌的生長有明顯抑制作用;4、活化的星狀細胞(activated hepatic stellate cell，aHSC)與肝癌細胞混合接種對肝癌細胞的成瘤有明顯促進作用;5、SYY對于aHSC和肝癌細胞混合皮下瘤的生長有抑制作用;6、SYY對aH