新城疫病毒抑制肝星狀細胞的活化及其逆轉(zhuǎn)小鼠肝纖維化的研究.pdf

1、肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是肝癌中最常見的組織學類型。在我國70％～90％HCC患者伴有肝硬化。在肝癌發(fā)病率呈上升趨勢的歐美國家，HCC的發(fā)生幾乎全部源于肝硬化的個體。而肝硬化嚴重影響了HCC治療方法的選擇、療效、并發(fā)癥及預后。目前認為，HCC合并肝硬化的發(fā)病機制基于兩個方面[1]：1）在損傷因子（如：肝炎病毒、黃曲霉素、代謝病和酒精等）存在下，肝細胞持續(xù)性受損、變性和壞死所致的炎性反應以及細胞

2、外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）合成過多，ECM不能被降解、吸收，從而導致在肝內(nèi)大量沉積，形成肝纖維化，最終則引起以纖維組織環(huán)繞增生肝細胞團的硬化結(jié)節(jié)，即肝硬化。在這一過程中，肝星狀細胞（hepaticstellatecell，HSC）由靜止狀態(tài)活化為成肌纖維細胞，大量分泌ECM，是肝纖維化發(fā)生乃至肝硬化進展的主要細胞學基礎。2）在肝纖維化炎性環(huán)境中產(chǎn)生的氧自由基等誘變物質(zhì)引起肝細胞DNA損傷，損傷的肝細胞應答旁

3、分泌細胞因子的刺激而增殖，這種不斷的損傷、再生誘發(fā)的多基因變異是導致肝細胞癌變的關鍵。
　　HSC活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因，肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。免疫組化研究顯示，HCC合并肝硬化中活化的HSC數(shù)量顯著增高，而肝癌細胞分泌的有絲分裂因子也具有促進HSC活化并增殖的作用[2]；活化HSC和癌變細胞的相互作用會進一步加重肝癌合并肝硬化程度。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個新的研究熱點。

4、目前，抑制肝纖維化的途徑主要集中在：阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）信號通路，以拮抗TGF-β在HSC活化中的作用[3,4]；減少細胞外基質(zhì)ECM的生成，降解組織中過量沉積的膠原纖維[5,6]。
　　新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是單股負鏈RNA病毒，屬副粘病毒科。由于多數(shù)RNA病毒具有天然地在腫瘤細胞選擇性復制的特點，近年來用這類病毒作為新型運

5、載工具在腫瘤基因治療方面引起了人們的關注。另一方面，NDV作為溶瘤病毒用于腫瘤治療已見臨床報道。NDV在腫瘤細胞選擇性復制的機制和腫瘤細胞的干擾素信號通路缺陷有關[7]。1976年，McGregor報道了NDV能夠在活化的T細胞中復制，并導致活化T細胞的死亡[8]；Fábián最近又報道了NDV能夠在轉(zhuǎn)化的細胞中高效地復制[9]?；诨罨疕SC是一種非正常的、具有增殖能力的細胞，我們提出假設：NDV能在這種活化的HSC中復制，并抑制HS

6、C的活化，進而達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的。本論文以抑制活化HSC為出發(fā)點，探討NDV在HSC中的復制率及其對肝纖維化相關基因在mRNA和蛋白水平的影響，并通過建立小鼠肝纖維化模型，研究NDV的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功能。
　　第一部分：NDV在人肝癌細胞條件培養(yǎng)基誘導活化HSC中的復制
　　目的：探討人肝癌細胞FHCC-98條件培養(yǎng)基（conditionedmedium,CM）對人肝星狀細胞LX-2活化的誘導作用；檢測NDV在LX-

7、2細胞中的復制率。方法：用不同百分含量的FHCC-98CM刺激LX-2細胞，MTT法檢測細胞的增殖率，TGF-β1為陽性對照。半定量及Real-time定量RT-PCR檢測40％CM（V/V）或2ng/mlTGF-β1刺激前后LX-2細胞中α-平滑肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）、Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissueinhibitorofmetalloproteinase-

8、1，TIMP-1）和TGF-β1四種活化相關基因的mRNA表達。用攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的重組NDV（NDFLtag-EGFP）感染不同傳代的LX-2細胞，熒光顯微鏡下觀察EGFP在細胞中的表達率和熒光強度，以反映NDV的復制率。用流式細胞術（flowcytometry,FACS）定量檢測NDFLtag-EGFP在40％CM或2ng/mlTGF-β1刺激活化的L

9、X-2細胞中的復制。結(jié)果：FHCC-98CM和TGF-β1均能夠刺激LX-2細胞的活化。低濃度的CM（10％～40％）更有利于LX-2細胞的增殖，40％CM刺激時的細胞增殖率最大，為25.8％。TGF-β1對LX-2細胞增殖的影響呈正相關，且具有劑量依賴性。與無刺激的對照組相比，CM或TGF-β1刺激LX-2細胞活化后，細胞中α-SMA、collagenⅠ、TIMP-1和TGF-β1四種基因的表達均有所增加。NDV隨著LX-2細胞的連續(xù)

10、傳代，其在細胞中的復制率也逐漸增加。FACS顯示，LX-2細胞分別經(jīng)40％CM和2ng/ml的TGF-β1刺激活化后，NDV在細胞中的復制率分別提高了1.76倍和1.52倍。結(jié)論：FHCC-98CM能誘導LX-2細胞活化并增殖，NDV在活化LX-2細胞中的復制率提高。
　　第二部分：NDV對HSC活化的抑制作用
　　目的：探討NDV在活化HSC中的復制對HSC的增殖以及細胞生物學功能的影響。方法：用不同滴度的NDV溶瘤株It

11、alien（NDV-Italien）感染經(jīng)CM刺激的LX-2細胞，MTT法檢測NDV對細胞增殖率的影響。免疫熒光顯微鏡技術檢測活化標志物α-SMA的表達變化。實時定量RT-PCR檢測NDV對四種活化相關基因α-SMA、collagenⅠ、TIMP-1和TGF-β1mRNA水平的影響。明膠酶譜法檢測MMP-2和MMP-9的分泌。結(jié)果：NDV的感染抑制了LX-2細胞的增殖，細胞增殖率和病毒滴度呈負相關關系。與未刺激組相比，NDV在CM刺激的

12、LX-2細胞中的增殖抑制率提高，四種基因的表達顯著性下調(diào)，MMP-2和MMP-9的分泌下調(diào)。結(jié)論：NDV在活化LX-2細胞中的復制具有抑制細胞增殖和HSC活化的作用。
　　第三部分：NDV對CCl4誘導的小鼠肝纖維化的逆轉(zhuǎn)
　　目的：通過體內(nèi)試驗探討NDV對CCl4誘導的小鼠肝纖維化的抑制作用。方法：體重約20g的昆明小鼠，每周兩次腹腔注射100μlCCl4/花生油溶液（20％,V/V），對照組同時注射100μl生理鹽水（P

13、S），連續(xù)注射8周。最后一次在CCl4注射后3天，尾靜脈注射200μl滴度為1,000HU（hemagglutinationunit）的NDV-Italien1次或每24h間隔連續(xù)注射3次。NDV注射24h后處死動物，取出肝臟進行大體形態(tài)觀察并拍照。肝組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片進行常規(guī)HE染色和Masson三色染色。新鮮肝組織用RIPA（non-ionicdetergent-containingbuffer）裂解液裂解，BC

14、A（bicinchoninicacid）蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，取50μg總蛋白上樣進行Westernblot檢測α-SMA的表達。新鮮肝組織進行冰凍切片，冷丙酮固定，免疫熒光雙染法檢測組織中α-SMA和NDV顆粒的表達和定位。結(jié)果：CCl4誘導8周后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化癥狀，可看到肝組織變硬、表面粗糙不平、密集分布大量的白色點狀斑塊。HE染色顯示，纖維化肝臟的組織結(jié)構(gòu)松散，竇周隙增大。Masson三色染色顯示膠原異常沉積。