羅非魚基因敲除技術(shù)的建立及其在性別決定與分化研究中的應(yīng)用.pdf

1、行有性生殖的生物都有兩種不同的性別，發(fā)育過程中都涉及到性別決定。因此，性別決定與分化及其分子機制是最基礎(chǔ)的生物學(xué)問題之一。哺乳類性別決定與分化是由一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號傳導(dǎo)因子連接成網(wǎng)構(gòu)成的協(xié)同作用通路，而硬骨魚類還不清楚。許多經(jīng)濟動物（養(yǎng)殖魚類）生長速率有明顯的性別差異，如尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）雄魚比雌魚生長快50％，單性魚養(yǎng)殖具有較高的經(jīng)濟價值，因此養(yǎng)殖魚類性別決定與分化的分子機制及性別控制成為水產(chǎn)動

2、物學(xué)研究的熱點，可以兼顧基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。隨著大片段基因組文庫的構(gòu)建和高通量DNA測序技術(shù)的發(fā)展，羅非魚基因組序列已經(jīng)公布，但缺乏Y染色體信息，有必要構(gòu)建含Y染色體信息的大片段基因組文庫。長期以來，養(yǎng)殖魚類缺乏有效的基因敲除手段嚴(yán)重阻礙了其性別決定和分化分子機制的研究。近幾年，人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)TALEN和CRISPR/Cas9的出現(xiàn)使我們能對任意物種的基因組進行定點編輯。因此，本研究將探索在羅非魚建立這兩種基因敲除技術(shù)，

3、并用于對dmrt1、foxl2、iff3和nanos等基因敲除，研究它們在性別決定與分化中的作用及分子機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以pCC2FOS為載體構(gòu)建羅非魚XY個體Fosmid基因組文庫，共挑選115200個單菌落，保存在300塊384孔板中，構(gòu)建4800個行池、7200個列池、300個板池和25個超級池，形成微陣列，并對其進行復(fù)制備份。該文庫插入片段平均長度為40 kb左右，覆蓋約羅非魚基因組的3倍。連續(xù)傳代實驗表明

4、，文庫具有良好的穩(wěn)定性。通過構(gòu)建超級池—板池—行、列池三級池系統(tǒng)形成微陣列，能快速、準(zhǔn)確、有效的篩選目的基因，僅需77個PCR反應(yīng)（超級池25+板池12+行池16+列池24）就能篩到含有目的基因的克隆，解決了普遍存在的文庫篩選難題。通過該文庫嘗試篩選了20個與性別分化相關(guān)基因，均獲得2～5個陽性克隆，說明文庫具有較好的實用性。羅非魚XY基因組大片段文庫的構(gòu)建，為性別特異分子標(biāo)記的篩選、性別決定候選基因的克隆、基因組編輯和遺傳育種等研究提

5、供了基礎(chǔ)。
　　2.TALEN基因組編輯技術(shù)已成功運用于多種模式生物。本研究在非模式生物羅非魚中建立TALEN靶向基因敲除技術(shù)，它能高效的對dmrt1和foxl2進行敲除，且最高敲除率達到81％，亞克隆測序證實靶位點產(chǎn)生多種刪除或插入不同數(shù)目堿基的突變類型。此外，TALEN誘導(dǎo)的高突變率個體在當(dāng)代(G0)就能產(chǎn)生明顯的表型。通過常規(guī)組織學(xué)、免疫組化、real-time PCR和激素測定等方法檢測了Dmrt1和Foxl2缺失對性腺性

6、別分化及相關(guān)基因表達的影響，結(jié)果顯示:XY個體Dmrt1缺失使精巢不能正常發(fā)育，如輸精管發(fā)育異常，精原細(xì)胞退化，甚至沒有生殖細(xì)胞，類固醇生成細(xì)胞增生等。Dmrt1缺失的XY個體無性逆轉(zhuǎn)發(fā)生。此外，與對照組精巢相比，Dmrt1缺失使精巢中foxl2、雌激素合成酶Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素(17β-雌二醇)水平升高。相反，XX個體Foxl2缺失使卵母細(xì)胞退化，Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素水平顯著降低;更

7、重要的是，部分Foxl2缺失的XX個體發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，并伴隨Dmrt1和雄激素合成酶Cyp11b2的表達。該研究證實TALEN能高效應(yīng)用于養(yǎng)殖魚類羅非魚的基因敲除;Dmrt1和Foxl2在性腺中拮抗性的參與羅非魚性別分化，它們主要通過調(diào)控Cyp19a1a的表達和雌激素的水平來影響性別分化。
　　3.新興的CRISPR/Cas9已在多個模式生物中證實能有效進行基因組編輯。本研究采用CRISPR/Cas9成功在非模式生物羅非魚進行nano

8、s2、nanos3、dmrt1和foxl2的敲除，最高突變率達到95％。CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的基因突變在當(dāng)代(G0)也能產(chǎn)生明顯的表型。通過GFP-vasa'3UTR標(biāo)記和生殖細(xì)胞特異表達Vasa染色證實，XY性腺缺失Nanos2和XX個體性腺腺缺失Nanos3均導(dǎo)致生殖細(xì)胞缺失，且性腺成中空管狀結(jié)構(gòu)。免疫組化結(jié)果顯示Nanos2缺失的XY精巢仍然表達Dmrt1和Cyp11b2;而Nanos3缺失的XX性腺體細(xì)胞雄性化，表達Dmr

9、t1和Cyp11b2，同時伴隨著敲除魚血清雄激素(11-KT)的上調(diào)和雌激素的下調(diào)。該結(jié)果表明無論基因型如何，生殖細(xì)胞缺失均導(dǎo)致性腺體細(xì)胞的雄性化。此外，CRISPR/Cas9敲除Dmrt1和Foxl2所產(chǎn)生的表型與TALEN敲除結(jié)果一致。CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的foxl2和dmrt1突變能通過生殖細(xì)胞高效傳遞到F1代。F1代中檢測到移碼和非移碼的foxl2突變體，這與其XX親本的突變類型相一致;然而，與dmrt1 XY親本突變類型

10、不一致，敲除魚的精子以及受精獲得的F1代中僅檢測到非移碼的突變，這說明Dmrt1對羅非魚精子發(fā)育和成熟具有重要作用。這些結(jié)果表明CRISPR/Cas9可用于羅非魚基因的高效、快速編輯，而且是可遺傳的。
　　4.最近，本實驗室發(fā)現(xiàn)一個僅在硬骨魚類存在的igf3，它只在性腺表達，然而，它在性腺發(fā)育過程中的表達模式、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及在性腺分化中的作用還有待闡明。我們通過real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)而igf3在孵化后5天到孵化后40天卵巢的

11、表達量高于精巢，而孵化后50天到孵化后70天低于精巢的表達。通過制備Igf3多克隆抗體，免疫組化檢測顯示Igf3在孵化后10天到成體雌雄性腺的體細(xì)胞中表達。利用Igf3重組蛋白處理原代培養(yǎng)的卵巢和精巢細(xì)胞，real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)Igf3以時間、劑量依賴的方式增強性腺分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子foxl2、dmrt1、nr5a1（sf1）和類固醇酶cyp19a1a、cyp11b2、cyp11a1、hsd3b2和cyp17a1的表達。通過C

12、RISPR/Cas9成功在XX、XY羅非魚敲除igf3基因，單條魚的突變率最高達到95％。Igf3缺失導(dǎo)致3月齡XY性腺中無精母細(xì)胞和精細(xì)胞、但存在精原細(xì)胞，精巢只有少量Cyp11b2表達;而對照組XY精巢存在各級生精細(xì)胞，且有大量Cyp11b2表達。Real-time PCR結(jié)果顯示:敲除魚性腺dmrt1、nr5a1和cyp11b2 mRNA的表達水平也明顯低于對照魚。與此相吻合，激素測定進一步證實敲除魚血清雄激素水平明顯低于對照魚。

13、另一方面， Igf3缺失導(dǎo)致3月齡XX卵巢中存在大量卵原細(xì)胞，極少的Ⅰ、Ⅱ時相卵母細(xì)胞，卵巢只有少量Cyp19a1a表達;而對照組XX卵巢已有大量各時相卵母細(xì)胞，只有邊緣存在少量卵原細(xì)胞，卵巢中大量的Cyp19a1a表達于間質(zhì)細(xì)胞。Real-time PCR結(jié)果也顯示:敲除魚foxl2、nr5a1和cyp19a1a mRNA的表達水平也明顯低于對照魚。與此相吻合，激素測定進一步證實敲除魚血清雌激素水平明顯低于對照魚。這些體外和體內(nèi)研究都

14、表明Igf3參與調(diào)控性別分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和類固醇酶的表達，且Igf3參與調(diào)控羅非魚生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂。最后，利用Fosmid文庫獲得的ig3啟動子序列，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體在HEK293細(xì)胞中進行啟動子分析發(fā)現(xiàn):igf3能直接被Nr5a1(Sf1)激活，而Foxl2、Nr0b1a(Dax1)和Nr0b1b(Dax2)單獨轉(zhuǎn)染沒有作用，但與Nr5a1共轉(zhuǎn)染時均能增強Nr5a1激活的igf3轉(zhuǎn)錄活性;然而，Dmrt1、雌激素在與受體共

15、轉(zhuǎn)染時抑制igf3的轉(zhuǎn)錄。Forskolin能增強Nr5a1和igf3的轉(zhuǎn)錄。此外，igf3在Dmrt1和Foxl2 TALEN敲除魚的表達升高。這些結(jié)果表明Igf3能調(diào)控foxl2、dmrt1、nr5a1和類固醇合成酶的表達，反之，igf3的表達又受到Foxl2、Dmrt1、Nr5a1和雌激素的調(diào)控，它們之間形成緊密的調(diào)控環(huán)作用于羅非魚生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂。
　　綜上所述:本研究建立了羅非魚微陣列Fosmid基因組文庫、TALEN