家蠶絲素重鏈基因敲除品系的建立及其應用.pdf

1、家蠶因其強大的泌絲吐絲能力而蜚聲古今中外，在長達數(shù)千年的飼養(yǎng)和馴化中為世界經(jīng)濟和文化交流做出了重要的貢獻。蠶絲纖維是復雜的蛋白質(zhì)微細纖維的集合體，具有優(yōu)良的光澤、色調(diào)、手感而且在吸濕性、吸氣性、對皮膚的親和性等許多方面具有出色的性能。然而蠶絲也有不耐磨、易黃化褪色等缺點，且強度也不如蜘蛛絲等纖維。因此如何改造蠶絲，使蠶絲獲得高繭絲強度、強延伸性、易染色、高肌膚親和性等優(yōu)質(zhì)性能一直是一個研究難題。
　　 由于家蠶是經(jīng)過數(shù)千年選育出

2、來的，普通的遺傳育種方法已很難改變其蠶絲特性，而蠶絲絲素重鏈的的高表達量、高度重復序列和高分子量使得用常規(guī)的轉(zhuǎn)基因技術也難以對其進行研究和改造。近些年發(fā)展起來的鋅指核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)技術由于其能特異性的識別靶向基因的DNA序列，并造成DNA的雙鏈斷裂(DSB)進而刺激機體自身的修復途徑，通過同源重組(Homologousrecombina-tion，HR)和非同源性末端鏈接(Non-homologou

3、sendjoining，NHEJ)兩種方式實現(xiàn)靶向基因的敲除和敲入。目前，這一技術已被廣泛的應用于動植物的基因敲除和定點改造之中。
　　 本研究以絲素重鏈基因為靶標，利用新近發(fā)展起來的鋅指核酸酶技術，以多化性家蠶品種“N4”和滯育性家蠶品種“大造”為顯微注射材料，高效的對家蠶絲素重鏈基因進行了敲除，首次獲得了包括在絲素重鏈基因N端非重復區(qū)域部分缺失、部分堿基突變或小片段插入的一系列突變家蠶品系。并完成了突變位點的測序分析、絲腺的

4、表型觀察及突變蠶繭與野生型家蠶蠶繭的比較分析;在絲素重鏈突變品系中高量表達了綠色熒光蛋白，不但為家蠶絲蛋白基因的遺傳改良提供了一種全新的思路和方法，也為利用家蠶絲腺作為生物反應器表達外源蛋白提供了有價值的參考。獲得的主要結果如下:
　　 1.根據(jù)對家蠶絲素重鏈基因的序列特征進行分析，及其在不同蠶品系中SNP分布情況，以及結合鋅指蛋白識別DNA序列的特性，我們選擇CTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGG

5、AGCA作為鋅指核酸酶識別的靶位點，該靶位點位于家蠶絲素重鏈基因的N端非重復區(qū)域，并據(jù)此設計和合成針對絲素重鏈基因的靶向敲除的鋅指核酸酶載體。
　　 2.我們將合成的FibH-ZFN的mRNA注射了多化性家蠶品種“N4”和滯育性家蠶品種“大造”兩個品種，分別在G1代的29和38個蛾圈中發(fā)現(xiàn)250和105頭突變體，其表型出現(xiàn)裸蛹或者繭層稀薄的“絲膠繭”。
　　 3.從篩選的突變體中選取117個表現(xiàn)型均為裸蛹或“絲膠繭”的突

6、變個體進行測序分析，測序結果表明所選取的117個突變個體在鋅指核酸酶靶位點均發(fā)生了突變，具體序列如SEQIDNO:2-118，這些突變包括變異、缺失和小片段的插入。
　　 4.解剖突變品系的家蠶和野生型家蠶，觀察他們絲腺，發(fā)現(xiàn)突變品系的絲腺明顯小于正常家蠶的絲腺，其后部絲腺也出現(xiàn)退化現(xiàn)象;比較它們的繭絲的細薄、繭層的厚度及繭絲的重量，突變品系都要小于野生型家蠶的繭絲;通過蛋白電泳對繭絲成分的分析，發(fā)現(xiàn)突變品系的繭絲不含絲素蛋白，