人工絲素重鏈(artFibH)的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)基因家蠶品系的構(gòu)建.pdf

1、蠶絲是一種復(fù)雜的微細(xì)纖維集合性天然蛋白，因具優(yōu)良的特性被廣泛使用和研究。然而力學(xué)性能上的一些缺陷，使得蠶絲的應(yīng)用范圍具有局限性。因此，蠶絲纖維的改性是拓展應(yīng)用振興產(chǎn)業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。蠶絲纖維的改性研究已有較長(zhǎng)歷史，改性的方法可分為物理改性、化學(xué)改性和遺傳改性。物理和化學(xué)的改性方法只是對(duì)蠶絲進(jìn)行修飾，不能從本質(zhì)上改變蠶絲蛋白特性，且成本高、工序繁瑣。利用遺傳操作技術(shù)對(duì)蠶絲基因進(jìn)行人工改造，能夠獲得性能更優(yōu)良且可穩(wěn)定遺傳的新品系。蜘蛛絲是已知?jiǎng)?/p>

2、物纖維中力學(xué)性能最優(yōu)越的絲纖維，其蛋白特性、組分及成絲過(guò)程與蠶絲具有相似性，因此不斷有學(xué)者嘗試在家蠶絲腺中表達(dá)蜘蛛絲來(lái)提高蠶絲的力學(xué)性能，但外源基因表達(dá)量低一直是無(wú)法攻克的難題。如果能通過(guò)編輯蠶絲自身的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)蠶絲性能的改良則是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛絲重復(fù)區(qū)域序列較比蠶絲的更加規(guī)則有序，這可能是蜘蛛絲強(qiáng)于蠶絲的重要原因。絲素重鏈Fib-H基因是絲蛋白最重要的結(jié)構(gòu)基因，具有長(zhǎng)片段的重復(fù)區(qū)域，決定著蠶絲力學(xué)性能。有研究者發(fā)現(xiàn)對(duì)Fi

3、b-H進(jìn)行截短后蠶絲的力學(xué)性能變差。那么，如果人為改造絲素重鏈?zhǔn)蛊湫蛄懈?guī)則，長(zhǎng)度更長(zhǎng)就有可能獲得保持天然特性的超強(qiáng)人工蠶絲。絲素重鏈高度重復(fù)和高GC含量的特性，使得利用常規(guī)的PCR技術(shù)和測(cè)序技術(shù)難以對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單地克隆及編輯。因此，我們采用人工組裝基因的方法對(duì)此設(shè)想做了初步的探索。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)Fib-H基因的序列特征，我們選擇重復(fù)序列最長(zhǎng)的第七個(gè)重復(fù)區(qū)（R07）和第六個(gè)非重復(fù)區(qū)（A06）作為一個(gè)重復(fù)單元，稱(chēng)為“

4、A06R07”。為保證人工絲素重鏈保持原來(lái)的序列特征，我們選擇了兩個(gè)IIs型限制內(nèi)切酶：BbsI和BsaI，在基因的兩條鏈上各含有一個(gè)BbsI和一個(gè)BsaI的識(shí)別序列，并且均設(shè)計(jì)在質(zhì)粒載體上。BbsI識(shí)別序列設(shè)計(jì)在A06R07序列的下游，其中一個(gè)設(shè)計(jì)在“A06R07”兩個(gè)堿基之后，酶切后A06R07序列露出3'端TTGT末端；BsaI識(shí)別序列設(shè)計(jì)在A06R07序列的兩端，其中一個(gè)設(shè)計(jì)在 A06R07序列的上游五個(gè)堿基之前，酶切后A06R

5、07序列形成5'端AACA末端，另一個(gè)BbsI和BsaI識(shí)別序列之間相距7個(gè)堿基，二者共用一個(gè)酶切位點(diǎn)，切出的一對(duì)粘性末端正好堿基互補(bǔ)，利用酶切連接的方法實(shí)現(xiàn)重復(fù)單元之間無(wú)縫連接加倍。⑵經(jīng)酶切驗(yàn)證，我們共成功構(gòu)建了由 Fib-H啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人工 Fib-H基因的piggyBac轉(zhuǎn)基因載體如下：pBac[R01A06R07R12]、pBac[R01(A06R07)3R12]、pBac[R01(A06R07)5R12]、pBac[R01(A0

6、6R07)3-Red-R12]、pBac[R01(A06R07)3-SELR13-R12]。以家蠶實(shí)用品系932為受體材料，利用顯微注射技術(shù)，制備了轉(zhuǎn)基因家蠶。通過(guò)熒光觀察篩選到陽(yáng)性個(gè)體。其中 pBac[R01(A06R07)3R12]有2個(gè)蛾圈，陽(yáng)性蛾圈率為0.2%，pBac[R01(A06R07)5R12]有1個(gè)蛾圈，陽(yáng)性蛾圈率為0.5%。⑶通過(guò)蛋白預(yù)測(cè)軟件分析3×型和5×型的人工Fib-H蛋白大小分別約為203KDa和295KDa

7、，均小于家蠶932品系Fib-H蛋白（350KDa）。通過(guò)SDS-PAGE銀染和Western Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)目的條帶并不明顯，因此推測(cè)可能是由于其蛋白分子量太大而且具有自組裝的特性，而滯留在點(diǎn)樣孔中；通過(guò)冷凍切片技術(shù)獲得單根繭絲的橫截面直徑，結(jié)果顯示野生型與人工型繭絲形態(tài)和直徑并無(wú)明顯差異，表明 artFibH的插入不會(huì)影響繭絲的正常形態(tài)和直徑大?。煌ㄟ^(guò)應(yīng)力應(yīng)變拉伸試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與WT型相比，人工3×型和5×型繭絲伸長(zhǎng)率