家蠶W染色體特異轉(zhuǎn)基因品系的建立及ZFN打靶初探.pdf

1、昆蟲不育技術(shù)(SterileInsectTechnique,SIT)是一種無污染并且物種特異的害蟲控制方法,是害蟲大面積綜合治理(AreaWide-IntegratedPestControl,AW-IPM)的重要組成部分。這一技術(shù)的廣泛運(yùn)用可以明顯減少人們對有機(jī)殺蟲劑在控制害蟲中的依賴,更好的保護(hù)生態(tài)環(huán)境。遺傳區(qū)性品系(geneticsexingstrains)是昆蟲不育技術(shù)中的重要課題,在害蟲防治中,單一釋放不育雄蟲要比雙性釋放效率高

2、,這主要是因?yàn)獒尫挪挥οx之間更傾向于同型交配,影響控制靶標(biāo)害蟲的效率;而且,許多害蟲的雌蟲起著主要的危害作用,雙性釋放會導(dǎo)致一些不必要的危害。更高效率地分離雌雄,有助于提高SIT項(xiàng)目的效率。
　　 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是鱗翅目的主要模式物種,在家蠶中發(fā)展遺傳區(qū)性品系有助于提升蠶絲產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益,對鱗翅目害蟲SIT項(xiàng)目也有參考價值。相對于雌蠶,雄蠶易養(yǎng)且不易患蠶病,食取的桑葉量少:雄蠶的吐絲量高,高出雌蠶約20%;雄蠶吐絲的品

3、質(zhì)也明顯優(yōu)于雌蠶。專養(yǎng)雄蠶一直是蠶桑生產(chǎn)者追求的目標(biāo)。前蘇聯(lián),日本和中國的研究者均進(jìn)行過一些有益的探索,其中,前蘇聯(lián)科學(xué)家Strunnikov通過傳統(tǒng)的輻射生物學(xué)及染色體易位技術(shù)培育出的性連鎖平衡致死品系最有實(shí)用價值,目前國內(nèi)推廣的雄蠶品種均是在該理論框架基礎(chǔ)上改造的。但Strunnikov的方法需要找到合適的標(biāo)記基因以及長期大量的篩選工作,很難在不同的物種間推廣,成本很高。Marco等人提出了一種通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),實(shí)現(xiàn)鱗翅目遺傳區(qū)性品系

4、的策略,在針對蘋果小卷蛾SIT項(xiàng)目中,一個條件致死基因插入到W染色體上,給予一定條件,雌性死亡,釋放的雄性(性染色體為ZZ型)為不含轉(zhuǎn)基因的個體,在不影響不育雄性競爭力的同時避免了轉(zhuǎn)基因會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害的擔(dān)憂。但鱗翅目轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)均為隨機(jī)插入,目前為止,仍然沒有W染色體轉(zhuǎn)基因插入的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 鋅指核酸酶(ZFNs)由識別特異DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)域和非特異性的核酸內(nèi)切酶Fokl兩部分組成。特異設(shè)計(jì)的ZFN可以介導(dǎo)靶D

5、NA序列的雙鏈斷裂(DSB),利用細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制(非同源末端連接NHEJ或同源重組修復(fù)HDR)引入基因突變,基岡修飾或基因添加,從而實(shí)現(xiàn)對生物體遺傳信息的定向改變。ZFNs已經(jīng)在多個物種和細(xì)胞中成功進(jìn)行了基因敲除或定點(diǎn)基因添加,隨著鋅指核酸酶技術(shù)的發(fā)展,利用該技術(shù)在家蠶中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因似乎變得可行。但對于家蠶來說,ZFN是否能夠?qū)崿F(xiàn)高效率基因打靶還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 本研究調(diào)查了家蠶160個轉(zhuǎn)基因系,統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因

6、陽性的性別比例,以期找到插入到W染色體上的轉(zhuǎn)基因系,再通過分子生物學(xué)方法,證明這一轉(zhuǎn)基因系;設(shè)計(jì)了GFP靶向的ZFN,以家蠶轉(zhuǎn)基因系pBac[Serl-Rcd-sv40,3xp3EGFP](該轉(zhuǎn)基因系繭殼發(fā)紅色熒光,復(fù)眼表達(dá)綠色熒光蛋白)為打靶對象,體外合成GFP-ZFN的mRNA,通過胚胎顯微注射該mRNA,探索GFP-ZFNmRNA對轉(zhuǎn)基因家蠶GFP基因的打靶效率。主要結(jié)果如下:
　　 1.W染色體轉(zhuǎn)基因家蠶的獲得
　

7、　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們調(diào)查了家蠶160個轉(zhuǎn)基因系,在對轉(zhuǎn)基因系的熒光分析中發(fā)現(xiàn),編號為158和159的轉(zhuǎn)基因系存在一定的性別熒光比例。我們對這兩組轉(zhuǎn)基因系與野生品系進(jìn)行了雜交或自交處理,158轉(zhuǎn)基因系的后代沒有出現(xiàn)性別和熒光比例的差異,159轉(zhuǎn)基因系的后代中,雌性個性全部為EGFP陽性個體,雄性個體部分為EGFP陽性,我們推測該轉(zhuǎn)基因系含有兩個轉(zhuǎn)基因插入拷貝,一個在常染色體上,另一個在性染色體上,進(jìn)一步對該轉(zhuǎn)基因系與野生品系進(jìn)行雜交分離

8、,得到編號為30-13的轉(zhuǎn)基因品系,后代中雌性全為轉(zhuǎn)基因陽性,雄性全為轉(zhuǎn)基因陰性。根據(jù)孟德爾遺傳定律推測,30-13轉(zhuǎn)基岡品系的為W染色體轉(zhuǎn)基因品系。
　　 2.W染色體轉(zhuǎn)基因家蠶的分子檢測
　　 我們首先提取了30-13雌性與30-13雄性的基因組,根據(jù)EGFP序列設(shè)計(jì)了引物,以野生雌雄蠶的基因組作為對照組,通過PCR檢測,初步證明了30-13轉(zhuǎn)基因品系為w染色體插入。為了確定30-13轉(zhuǎn)基因品系的拷貝數(shù),我們對該品系

9、做了Southernblot檢測,運(yùn)用了兩組內(nèi)切酶(Xbal和Bgill)對30-13轉(zhuǎn)基因品系的雌雄蠶基因組進(jìn)行酶切,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,30-13轉(zhuǎn)基因品系為單拷貝插入,反向PCR結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)位于W染色體上。
　　 3.GFP-ZFN的mRNA打靶效率的初探
　　 本實(shí)驗(yàn)選取家蠶轉(zhuǎn)基因系pBac[Serl-Red-sv40,3xp3EGFP]為基因打靶實(shí)驗(yàn)品種,我們設(shè)計(jì)了GFP靶向的鋅指核酸酶,鋅指核酸酶核酸