WD0631和WD0632轉(zhuǎn)基因果蠅品系的構(gòu)建及與CI的關(guān)系.pdf

1、沃爾巴克氏體(Wolbachia)是一類普遍存在于節(jié)肢動(dòng)物和絲蟲線蟲體內(nèi)的革蘭氏陰性菌，Wolbachia具有多種操控宿主生殖的方式，如孤雌生殖、殺雄、精卵細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)和雌性化。其中細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)是最常見(jiàn)也是研究的最多的一種表型，即當(dāng)感染了Wolbachia的雄性和未感染或感染不同Wolbachia的雌性宿主交配時(shí)，會(huì)導(dǎo)致后代胚胎孵化率很低或?yàn)榱?。精卵?xì)胞質(zhì)不親和引起受精卵第一次分裂時(shí)，來(lái)自父本的染色質(zhì)濃縮缺陷，雄性原核的

2、發(fā)育速度滯后，形成染色質(zhì)間橋，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止，從而引起胚胎死亡。雖然已有許多研究提出了多種解釋CI表型產(chǎn)生的模型，但是Wolbachia誘導(dǎo)產(chǎn)生CI的分子機(jī)理尚在探究中。
　　有研究者用SDS-聚丙烯凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，在感染W(wǎng)olbachia的尖音庫(kù)蚊卵巢以及與感染W(wǎng)olbachia雄蚊交配后的雌蚊受精囊中都檢測(cè)到了Wolbachia基因wPip_0282編碼的56kDa的蛋白。通過(guò)與多種不同種Wolbachia編碼的蛋白

3、同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與wPip_0282及其同源下游共轉(zhuǎn)錄基因wPip_0283編碼的蛋白具有同源性的Wolbachia蛋白只存在于能夠誘導(dǎo)CI產(chǎn)生的Wolbachia中。在wMe1Wolbachia菌株中只有wMe1_0631和wMe1_0632與wPip_0282和wPip_0283編碼的蛋白具有同源性，編碼wMe1_0631和wMe1_0632蛋白的基因?yàn)閃D0631和WD0632。因此，為了探究WD0631和WD0632是否和CI發(fā)生

4、相互關(guān)聯(lián)，本研究提取Dme1wMe1果蠅基因組DNA，從中擴(kuò)增出Wolbachia基因WD0631和WD0632的CDS全長(zhǎng)，將擴(kuò)增的WD0631基因和pEASY-T1載體連接，構(gòu)建成pEASY-T1-WD0631質(zhì)粒。pEASY-T1-WD0631質(zhì)粒經(jīng)過(guò)glⅡ和KpnⅠ雙酶切后與雙酶切后的pUAST表達(dá)載體相連接，形成重組質(zhì)粒pUAST-WD0631。將重組質(zhì)粒pUAST-WD0631和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒P△2-3按照一定的比例混合，將混合

5、質(zhì)粒通過(guò)胚胎顯微注射技術(shù)，注入w1118品系果蠅早期胚胎的生殖質(zhì)中，注射后成活的果蠅可通過(guò)重組質(zhì)粒中帶有的mini-white眼色標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，得到轉(zhuǎn)基因成功的果蠅。將獲得的有眼色的果蠅與平衡子品系果蠅進(jìn)行雜交，逐步完成染色體的平衡和定位，最終獲得純合的轉(zhuǎn)基因果蠅。將擴(kuò)增的WD0632基因和pEASY-T1載體連接pEASY-T1-WD0632質(zhì)粒。pEASY-T1-WD0632質(zhì)粒經(jīng)過(guò)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后，將純化的酶切后WD

6、0632基因與雙酶切后的pUAST表達(dá)載體相連接，但是經(jīng)過(guò)多次嘗試，均未連接成功，最后本研究沒(méi)能得到重組質(zhì)粒pUAST-WD0632。
　　為了研究pUAST-WD0631轉(zhuǎn)基因果蠅是否會(huì)產(chǎn)生CI相關(guān)表型，將nosGal4和bamGal4品系果蠅分別和轉(zhuǎn)基因品系雜交，通過(guò)UAS/Ga14系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)WD0631基因分別在果蠅生殖腺和精巢中過(guò)表達(dá)，然后通過(guò)RT-qPCR的方法檢測(cè)了WD0631基因在果蠅精巢中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，

7、WD0631基因在轉(zhuǎn)基因果蠅中極顯著升高(p＜0.01)，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)成功。為了進(jìn)一步研究WD0631基因?qū)D(zhuǎn)基因雄性果蠅后代繁殖力的影響，本研究分別用actGal4、nosGal4和bamGal4驅(qū)動(dòng)的WD0631過(guò)量表達(dá)的一日齡雄蠅與未感染果蠅三日齡處女蠅交配，統(tǒng)計(jì)后代胚胎孵化率和產(chǎn)卵量，結(jié)果顯示，后代的胚胎孵化率和產(chǎn)卵量與對(duì)照組相對(duì)比并沒(méi)有呈現(xiàn)出差異(p＞0.05），說(shuō)明WD0631基因單獨(dú)作用不能對(duì)果蠅繁殖力產(chǎn)生影響。WD063

8、1基因和WD0632為上下游基因，并發(fā)生共轉(zhuǎn)錄，因此兩個(gè)基因可能在一起發(fā)揮作用才能誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生CI。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了Wolbachia基因WD0631分別在果蠅Ⅱ和Ⅲ號(hào)染色體上的純合轉(zhuǎn)基因果蠅品系，初步分析表明，整合在果蠅基因組中的Wolbachia基因WD0631能在果蠅體內(nèi)過(guò)表達(dá)，但是過(guò)表達(dá)的WD0631基因還不足以影響果蠅后代繁殖力，推測(cè)基因WD0631和WD0632共同發(fā)揮作用才有可能影響果蠅后代的繁殖力，