重組家蠶絲素非結晶區(qū)肽段的制備與表征.pdf

1、家蠶絲素有出眾的機械性能和生物相容性，近年來越來越多的應用于組織工程支架材料，家蠶絲素是一種結構蛋白，蛋白空間結構和機械性能取決于它的氨基酸組成和序列。因此為了更好地控制基于蠶絲的生物材料的力學性能、空間結構、聚集態(tài)結構、降解速率等以適應不同組織支架要求，研制出更理想的材料，及解析其用作生物材料的生物功能機理，需要系統(tǒng)的研究與分析絲素蛋白組成-空間結構-功能之間的關系?；蚬こ碳夹g是系統(tǒng)研究蛋白質結構-功能的一種重要手段。家蠶絲素由重鏈

2、、輕鏈和P25蛋白組成，重鏈是主要組成部分，在絲素中扮演了一個非常重要的角色。重鏈主要由結晶區(qū)和非結晶區(qū)組成，采用基因工程技術研究結晶區(qū)及類結晶區(qū)結構組裝已有文獻報導。本文主要研究家蠶絲素重鏈非結晶區(qū)，通過基因工程的方法設計家蠶絲素重鏈非結晶區(qū)的基因序列，采用微生物表達系統(tǒng)大量制備蛋白、分離純化,并初步對表達產物進行了結構分析，為研究非結晶區(qū)序列的生物功能及對重鏈分子的結構性能影響提供材料制備方法。
　　分析并根據家蠶絲素重鏈非結

3、晶區(qū)結構的特點設計了類家蠶絲素非結晶區(qū)肽段基序的編碼基因f(1)。通過基因工程技術首尾相連的方法，對設計的序列進行延伸加倍，構建了含不同倍數非結晶區(qū)編碼基因的質粒，分別為F(1)，F(2)，F(3)，F(4), F(8)和 F(12)。將各種序列長度基因分別克隆進pGEX-KG和PET-30(a)兩種系列的表達載體，前者表達產物為His-融合蛋白，后者為GST-融合蛋白。采用DNA核酸電泳初步鑒定了克隆質粒和表達載體構建的正確性，并進一

4、步通過DNA測序表明家蠶絲素非結晶肽段基因成功地克隆并加倍至12倍，以及成功地構建了表達載體，沒有發(fā)生任何基因突變和缺失。
　　將構建的表達載體轉染大腸桿菌中誘導獲得表達。經過 SDS-PAGE電泳和Western印跡技術分析表明表達載體pGEX-KG能更好地表達目的蛋白，得到了可溶性的融合蛋白。本文重點表達了非結晶區(qū)基序4倍和8倍的多肽，標記為GST-F(4)B, GST-F(8)B。對兩種融合蛋白的表達條件進行了優(yōu)化，調查了不

5、同誘導劑濃度(0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L)和不同誘導培養(yǎng)時間(2，4，6，8 h)對GST-F(4)B, GST--F(8)B表達的影響，結果表明兩種融合蛋白GST-F(4)B和GST-F(8)B均在IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導時間為6h時表達量最高。為收集目的蛋白及定量分析表達效果，總蛋白采用GST親和層析柱進行純化并用紫外吸收法測定蛋白濃度，定量分析獲得的兩種融合蛋白表達量每升菌液最大能達23mg和

6、14mg左右。
　　對GST-F(4)B, GST-F(8)B進行了氨基酸組成分析，采用Thrombin酶進行酶切從GST融合蛋白中釋放出目的蛋白F(4)B和F(8)B。Zeta-電位儀等電點分析結果為融合蛋白GST-F(4)B和GST-F(8)B的PI在4和5之間,目的蛋白F(4)B和F(8)B的PI在2和3之間，實測值與軟件預測結果基本符合。采用CD圓二色光譜對F(4)B和F(8)B二級結構進行了初步探索，新鮮制備的溶液中F(