再生家蠶絲素蛋白對T-B細胞的影響及創(chuàng)面降解速率的實驗研究.pdf

1、目的：研究再生家蠶絲素蛋白對T、B淋巴細胞影響作用及其在創(chuàng)面的降解速率。
　　 方法：
　　 1、可溶性再生家蠶絲素蛋白體內(nèi)外對淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 1.1再生家蠶絲素蛋白體外對T淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 將可溶性膜狀再生家蠶絲素蛋白以RPMl1640配制成的絲素蛋白溶液，分別和人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以及大鼠淋巴結(jié)細胞懸液進行

2、共培養(yǎng)，調(diào)整絲素蛋白溶液終濃度為0.01％和0.1％，72 h后觀察其活化狀態(tài)，并采用MTT試驗檢測增殖情況。
　　 1.2再生家蠶絲素蛋白體內(nèi)對B淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 將可溶性再生家蠶絲素蛋白與福氏佐劑進行乳化后免疫新西蘭家兔，抗原用量為15 mg/kg體重，加強免疫4～5次后，采用免疫雙擴散法檢測免疫血清中特異性抗體，紫外分光光度法檢測血清中球蛋白。
　　 2、不可溶性再生家蠶多孔絲素膜在體內(nèi)的降解速率和

3、對免疫細胞的影響作用
　　 2.1再生家蠶多孔絲素膜在體內(nèi)的降解速率研究
　　 用125I標記再生家蠶多孔絲素膜，檢測標記率和標記穩(wěn)定性。在SD大鼠背部切除皮膚建立創(chuàng)面，125I-再生多孔絲素膜覆在創(chuàng)傷面，再將切除皮膚的表皮覆于再生多孔絲素膜上進行縫合。在術(shù)后不同時間點采用單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（Single-Photon Emission Computed Tomography，SPECT）進行顯像，并用ROI（R

4、egion of interest）技術(shù)進行分析。示蹤至同位素信號消失，處死大鼠取各個臟器進行體內(nèi)分布檢測。
　　 2.2再生家蠶多孔絲素膜在創(chuàng)面對免疫細胞的影響
　　 大鼠處死后，取創(chuàng)面皮膚經(jīng)HE染色后對其中的炎癥細胞進行分析。術(shù)后3 d、14 d、28 d、56 d取抗凝血分離PBMC并在55 d取脾臟細胞經(jīng)雙色免疫熒光及流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測CD3＋CD25＋T/CD3＋T細胞的比率

5、。
　　 結(jié)果：
　　 1、可溶性再生家蠶絲素蛋白材料對T、B淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 1.1再生家蠶絲素蛋白體外對T淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 兩種濃度再生家蠶絲素蛋白溶液刺激PBMC后MTI試驗OD值和陰性對照一致，和陽性對照有顯著性差異。大鼠淋巴結(jié)細胞的刺激結(jié)果和上述一致。
　　 1.2再生家蠶絲素蛋白體內(nèi)對B淋巴細胞的激發(fā)作用
　　 可溶性再生家蠶絲素蛋白的免疫血清在免疫雙擴散試驗中

6、未出現(xiàn)陽性沉淀線，而陽性對照則出現(xiàn)了相應(yīng)的沉淀線。兩種物理狀態(tài)的絲素蛋白免疫血清中的球蛋白含量和陰性對照一致，和陽性對照有顯著性差異。
　　 2、再生家蠶絲素膜在創(chuàng)面的降解和對T細胞的影響作用
　　 2.1同位素示蹤法研究再生家蠶多孔絲素膜在創(chuàng)面的降解速率
　　 125I標記再生多孔絲素膜的標記率為（21.1±1.11）％，標記后穩(wěn)定性較好。術(shù)后植入原位的同位素信號強度隨時間延長逐漸降低，至55天時同位素信號基本

7、消失，ROI分析殘留率隨時間延長也逐漸降低，至55 d時為（3.39±2.59）％。體內(nèi)分布試驗各個器官的放射性活度均較低，相比較而言，腎臟分布較高，其％ID/g為0.29±0.06。淋巴器官分布均較低。
　　 2.2再生家蠶多孔絲素膜在創(chuàng)面對免疫細胞的影響
　　 植入原位組織經(jīng)HE染色后觀察到少量的絲素成分，其比例和ROI結(jié)果較為一致。炎癥反應(yīng)較弱。再生多孔絲素膜植入后3 d，PBMC中 CD3+CD25+/CD3+T