γ射線照射對(duì)絲素蛋白生物相容性及降解性的影響.pdf

1、【目的】：
　　為研究γ射線對(duì)絲素蛋白的生物相容性及降解性的影響，本研究通過(guò)對(duì)γ射線照射后絲素蛋白力學(xué)性能的測(cè)試，篩選出能進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)的照射劑量，并利用細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)照射后絲素蛋白的生物相容性及降解性進(jìn)行研究。
　　【方法】：
　　1.γ射線照射后絲素蛋白膜的力學(xué)結(jié)構(gòu)變化情況：將制作好的絲素蛋白膜，加入分別為0、25、50、100、200、300、500、1000kGy的γ射線照射組。（1）絲素蛋白膜斷裂強(qiáng)度

2、和斷裂伸長(zhǎng)率變化：將絲素蛋白膜用特制的模具，制成啞鈴狀條帶，對(duì)各組絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率進(jìn)行測(cè)試。（2）絲素蛋白膜結(jié)構(gòu)變化的測(cè)試：將照射后的絲素蛋白膜剪碎制成粉末，用KBr壓片，經(jīng)Nicolet5700 FTIR型傅立葉變換紅外光譜儀檢測(cè)。2.γ射線照射后的絲素蛋白生物相容性研究：將SD大鼠乳鼠頸椎脫臼處死后，取其背部皮膚，分離原代真皮細(xì)胞培養(yǎng)傳至3、4代。（1）真皮細(xì)胞在絲素蛋白膜上的生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將原代培養(yǎng)的真皮細(xì)胞以每孔

3、1×105細(xì)胞，接種于鋪在24孔板中的輻照絲素蛋白膜上，培養(yǎng)7 d，每天各取6孔，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處，測(cè)得OD值，并計(jì)算細(xì)胞量，求得生長(zhǎng)曲線。（2）絲素蛋白浸提液細(xì)胞毒性試驗(yàn)：用制備好的絲素蛋白浸提液培養(yǎng)原代真皮細(xì)胞，以每孔5000個(gè)，接種于3塊96孔板中，待細(xì)胞貼壁后移去普通培養(yǎng)基，加入絲素蛋白膜浸提液，100μL/孔，培養(yǎng)1、3和6 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取一板，加入CCK-8溶液反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀

4、測(cè)得各孔OD值。（3）溶血試驗(yàn)：取志愿者全血制成稀釋血。設(shè)生理鹽水、雙蒸水、絲素蛋白浸提液及含絲素蛋白膜的生理鹽水4個(gè)組。每個(gè)試管加入0.2 mL稀釋血，37℃水浴60 min。反應(yīng)后的溶液以1000 r/min離心5 min，取上清液移入96孔板中，使用酶標(biāo)儀于545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。3.生物相容性及降解作用的體內(nèi)研究：將不同劑量（25kGy、50kGy、100kGy、200kGy）γ射線照射后的絲素蛋白膜植入SD大鼠皮下，植入

5、后7、14、28、56、84天，剖殺取材。對(duì)植入部位的皮下組織進(jìn)行病理檢查，通過(guò)ELISA法檢測(cè)絲素蛋白植入后的大鼠血清中IL-6和TNF-α含量；取出植入后的絲素蛋白稱(chēng)重，計(jì)算質(zhì)量減少率并繪制質(zhì)量減少曲線。
　　【結(jié)果】：
　　1.γ射線照射后絲素蛋白膜的力學(xué)結(jié)構(gòu)變化情況：經(jīng)過(guò)0、25、50、100、200、300、500、1000kGy的γ射線照射后，絲素蛋白的斷裂強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng)率隨照射劑量的增加，均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。紅外

6、光譜儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，γ射線照射后的絲素蛋白Silk II的吸收峰1628 cm-1、1526 cm-1并未發(fā)生明顯移動(dòng)，說(shuō)明γ射線對(duì)絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不明顯。2.γ射線照射后的絲素蛋白生物相容性研究：原代真皮細(xì)胞在絲素蛋白膜上的生長(zhǎng)情況良好，增殖表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，均在生長(zhǎng)96h達(dá)到峰值，而后下降，對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活力進(jìn)行單因素方差分析，各組吸光度值均具有方差齊性，且各組細(xì)胞增殖活力之間不存在顯著性差異(p>0.05)。（2）細(xì)胞

7、用絲素蛋白浸提液培養(yǎng)24、72和144 h，分別測(cè)定增殖情況，并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其毒性在分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的1級(jí)（RGR:75%－99%）以?xún)?nèi)，經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析，各時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞RGR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。細(xì)胞增殖趨勢(shì)也具有一致性。（3）絲素蛋白浸提液及含絲素蛋白的生理鹽水，溶血率均小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的5%，SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組溶血率之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。3.生物相容性及降解性的體內(nèi)研究：將

8、各組絲素蛋白膜植入SD大鼠背部皮下，并以空白植入作為對(duì)照，排除手術(shù)引起炎癥反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)植入的絲素蛋白均未引起明顯的炎癥反應(yīng)，并且隨時(shí)間變化，較高劑量照射組的絲素蛋白裂解較為明顯。各照射劑量絲素蛋白膜植入組的SD大鼠，IL-6和TNF-α分泌沒(méi)有顯著性差異（p>0.05），與空白植入組（Blank）比較，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白并未引起明顯炎癥反應(yīng)（p>0.05）。絲素蛋白在體內(nèi)降解性表現(xiàn)為，較高劑量照射組的絲素蛋白在體內(nèi)降解隨時(shí)間的延長(zhǎng)碎片形成