人胎盤(pán)源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離鑒定及其與再生柞蠶絲素蛋白生物相容性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)屬于成體干細(xì)胞的一種，能夠在體外擴(kuò)增，具有自我更新和多向分化的潛能，并且在機(jī)體組織自我更新和修復(fù)等方面具有重要意義。另外，MSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs正越來(lái)越受到人們的關(guān)注。MSCs來(lái)源廣泛，最先在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，但是在取材過(guò)程中存在造成感染的危險(xiǎn)，且人體骨髓中MSCs的含量極其稀少。隨著年齡的增加，骨髓中MSCs的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降，因

2、此有必要尋找新型MSCs來(lái)源。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)中含有豐富的MSCs，和骨髓MSCs一樣，人胎盤(pán)源MSCs(placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs)也能夠在合適的條件下進(jìn)行多向分化。再生柞蠶絲素蛋白是一種新型的生物材料，除具有與再生家蠶絲素蛋白相似的化學(xué)組成外，柞蠶絲素蛋白具有利于細(xì)胞黏附的RGD序列。目前，關(guān)于再生柞蠶絲素蛋白與人PMSC生物相容性的研究，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

3、本研究在成功建立人PMSCs體外分離和擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，探討柞蠶絲素蛋白和人PMSCs的生物相容性，從而為以再生柞蠶絲素蛋白作為新型生物支架材料和人PMSCs作為新型種子細(xì)胞構(gòu)建“工程骨”的臨床運(yùn)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分人胎盤(pán)源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定 目的：從胎盤(pán)組織中分離獲得人PMSCs，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，為人PMSCs應(yīng)用于組織工程和細(xì)胞治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將人胎盤(pán)組織

4、經(jīng)膠原酶消化、貼壁和傳代培養(yǎng)獲得PMSCs，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)其表面標(biāo)志，分別聯(lián)合應(yīng)用β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松體系和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、地塞米松體系將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，繼而采用堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)和von kossa染色對(duì)其進(jìn)行成骨分化鑒定，采用油紅染色對(duì)其進(jìn)行脂肪分化鑒定。 結(jié)果：從人胎盤(pán)中成功分離獲得人PMSCs，形態(tài)呈纖維狀，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)；流式細(xì)胞儀分析顯示，P

5、MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD106和CD166，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR；PMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后，ALP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，von kossa染色可見(jiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)；PMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，油紅染色呈陽(yáng)性，有明顯的脂滴出現(xiàn)。 結(jié)論：建立了有效分離、擴(kuò)增PMSCs的實(shí)驗(yàn)體系，并能使其在體外誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，表明PMSCs可作為新型來(lái)源的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程。 第二部分人胎盤(pán)源間

6、充質(zhì)干細(xì)胞與柞蠶絲素蛋白生物相容性的研究 目的：研究人PMSCs與再生柞蠶絲素蛋白的生物相容性，為人PMSCs聯(lián)合柞蠶絲素蛋白在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將人胎盤(pán)組織經(jīng)膠原酶消化、貼壁和傳代培養(yǎng)獲得人PMSCs，培養(yǎng)三代后的人PMSCs用于實(shí)驗(yàn)。采用柞蠶絲素蛋白溶液包被細(xì)胞培養(yǎng)板制成生物材料膜。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算人PMSCs在再生柞蠶絲素蛋白膜上的貼壁率；MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)人PMSCs在再生柞蠶絲素

7、蛋白膜上的增殖；在光鏡下觀察人PMSCs在再生柞蠶絲素蛋白膜上生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)的變化；FCM檢測(cè)人PMSCs在再生柞蠶絲素蛋白膜上生長(zhǎng)表型的變化。 結(jié)果：在1h觀察到再生柞蠶絲素組對(duì)PMSCs的貼壁率明顯高于再生家蠶絲素組、膠原組和聚苯乙烯培養(yǎng)板組。MTT結(jié)果顯示，在1 d時(shí)PMSCs在再生柞蠶絲素膜上的增殖明顯高于再生家蠶絲素蛋白組。HE染色的結(jié)果顯示，細(xì)胞在再生柞蠶絲素蛋白膜上的鋪展與膠原和聚苯乙烯培養(yǎng)板相似，優(yōu)于再生家蠶絲素蛋白

8、。FCM檢測(cè)的結(jié)果顯示，再生柞蠶絲素蛋白對(duì)人PMSCs表面抗原的表達(dá)無(wú)明顯影響。 結(jié)論：人PMSCs在再生柞蠶絲素蛋白上能夠很好地黏附、生長(zhǎng)并維持其正常的形態(tài)和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。人PMSCs與再生柞蠶絲素蛋白具有良好的生物相容性。 本研究成功建立了有效分離、擴(kuò)增人PMSCs的實(shí)驗(yàn)體系，并鑒定了其多向分化的潛能。在此基礎(chǔ)上，探討了再生柞蠶絲素蛋白對(duì)人PMSCs體外擴(kuò)增的支持作用，結(jié)果顯示再生柞蠶絲素蛋白體外支持人PMSC