生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血對早產(chǎn)兔腦組織葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的影響.pdf

1、目的:
　　生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricularhemorrhage，GM-IVH)是早產(chǎn)兒顱內(nèi)出血最常見的類型。在過去的幾十年中，隨著醫(yī)療技術(shù)水平及護理水平的提高，早產(chǎn)兒的存活率顯著增加，但對于孕周小，出生體重低的早產(chǎn)兒而言，GM-IVH的發(fā)病率仍是一個主要問題。GM-IVH可留有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如癲癇、認知異常、腦癱等，因此GM-IVH及其導致的

2、神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥仍然是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。當前對于GM-IVH后繼發(fā)性腦損傷機制還不是十分清楚。早產(chǎn)兒發(fā)生GM-IVH后常常合并側(cè)腦室擴張，除對癥治療外，目前尚無有效的治療手段，腰椎穿刺是主要的對癥治療方法之一，目的是釋放出聚積在側(cè)腦室內(nèi)和腦脊液中的陳舊出血、增高的蛋白質(zhì)以及過多的腦脊液，保持腦脊液循環(huán)通路的暢通，防止側(cè)腦室持續(xù)擴張，形成嚴重的腦積水，減輕對腦組織的壓迫。通過腰椎穿刺方法，對引流出的腦脊液進行動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)了一個十

3、分突出的現(xiàn)象，這類早產(chǎn)兒腦脊液糖的含量持續(xù)低于正常早產(chǎn)兒參考值，但患兒血糖正常，Volpe總結(jié)如下:這種無法用炎癥解釋的腦脊液糖濃度的降低發(fā)生于出血后第1天，5-15天最明顯，常常持續(xù)數(shù)周，最長持續(xù)至出血后3個月。大腦的能量來源主要依賴于葡萄糖，而葡萄糖從血液進入腦細胞必須通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucosetransport1，GLUT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3(glucose transport3，GLUT3)的介導。在先天性GLUT1

4、缺乏癥的患兒中，腦脊液中糖含量低于正常值，而同一時間的血液中的糖濃度是正常的，腦脊液/血葡萄糖之比降低，乳酸的含量正?；蚪档停珻T、MRI腦部影像學正常，EEG表現(xiàn)為背景波較慢，多有彌漫性或局灶性的異常放電，患兒常表現(xiàn)為抗癲癇藥物治療無效的癲癇發(fā)作，發(fā)育遲緩，獲得性小頭畸形，共濟失調(diào)、智力低下等。目前對GM-IVH患兒腦脊液糖濃度降低的機制不清楚，是否參與了繼發(fā)性腦損傷也不清楚？最初認為腦脊液糖濃度降低是由于紅細胞的消耗和無氧糖酵解的增

5、加，但隨后均因為腦脊液紅細胞清除后和乳酸濃度正常，糖濃度依然持續(xù)在低水平而被否決，有學者猜測可能因為出血破壞了腦內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運導致了腦脊液持續(xù)的糖濃度降低。查閱文獻未見相關(guān)的報道。本實驗通過GM-IVH動物模型，應用蛋白印跡實驗方法，定量分析了腦室周圍腦組織GLUT1、GLUT3蛋白的表達，探討GM-IVH后腦脊液糖濃度降低的可能機制，為臨床提供新的治療手段開辟思路。
　　方法:
　　1、將懷孕29天的新西蘭孕兔進行剖宮產(chǎn)，

6、迅速將幼兔取出，并給予保溫、奶粉喂養(yǎng)。將幼兔隨機分為兩組，在生后3小時之內(nèi)，其中一組的早產(chǎn)兔給予50％的丙三醇，劑量按10ml/Kg，經(jīng)腹腔注射，另一組的早產(chǎn)兔不給予任何處理。
　　2、兩組早產(chǎn)兔分別于生后24小時接受頭顱超聲檢查，觀察GM-IVH發(fā)生情況。選取接受丙三醇注射后發(fā)生GM-IVH的早產(chǎn)兔15只，為模型組，未給予任何處理的未發(fā)生GM-IVH的早產(chǎn)兔15只，為對照組，然后將兩組分別隨機分為生后24h、48h、72h三個亞

7、組，按上述時間點給予麻醉，由內(nèi)向外迅速選取腦室周邊區(qū)域組織，一部分新鮮腦組織放入4％多聚甲醛溶液中固定，供后期蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，以觀察早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織細胞形態(tài)的變化，另一部分新鮮腦組織立即用液氮冷凍，然后將標本放到-80℃冰箱，供蛋白印跡實驗用，用蛋白印跡法檢測對照組與模型組早產(chǎn)兔腦組織的GLUT1蛋白和GLUT3蛋白的表達。
　　3、統(tǒng)計方法:采用

8、SPSS13.0統(tǒng)計學軟件、Microsoft Excel2003進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（(x)±SD）表示，均數(shù)比較前先行方差齊性檢驗，不同時間點多個樣本均數(shù)的比較采用LSD法（Least-significant Difference）檢驗，兩個樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗(Independent Samples Test)，若不滿足方差齊性檢驗則采用秩和檢驗(rank-sum test)的方法。檢驗水準定為0.05

9、，P值小于0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、成功的建立了早產(chǎn)兔Ⅲ度GM-IVH模型
　　通過頭顱超聲、大體標本觀察、腦組織HE染色觀察證實早產(chǎn)兔GM-IVH模型的成功制備。
　　2、腦組織GLUT1蛋白的表達
　　用蛋白印跡實驗方法檢測早產(chǎn)兔腦組織GLUT1的表達，對照組腦組織標本中GLUT1表達量在生后24h、48h、72h是逐漸減少的，三個時間點間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);模

10、型組早產(chǎn)兔腦組織標本中GLUT1表達量在生后24h、48h、72h三個時間點間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后24h最高，其次是生后48h，最后是生后72h;模型組早產(chǎn)兔腦組織標本中GLUT1蛋白量在生后72h低于同一時間點的對照組，而生后24小時、48小時的蛋白量均高于同一時間點的對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、腦組織GLUT3蛋白的表達
　　用蛋白印跡實驗方法檢測早產(chǎn)兔腦組織GLUT3表達，對

11、照組腦組織標本中GLUT3表達量在生后24h、48h、72h是逐漸增多的，三個時間點間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);模型組早產(chǎn)兔腦組織標本中GLUT3表達量在生后24h、48h、72h三個時間點間兩兩比較亦有差異(P＜0.05)，以生后48h最高，其次是生后24h，最后是生后72h，模型組早產(chǎn)兔腦組織標本中GLUT3蛋白量在生后24h與對照驗組同一時間點相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，72h的蛋白量低于同一時間點

12、的對照組，而48小時的蛋白量高于同一時間點的對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、正常早產(chǎn)兔在生后72小時內(nèi)隨著生后日齡的增長，腦部GLUT1蛋白量是減少的，而GLUT3蛋白量是增多的。
　　2、早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT1表達量的上調(diào)，代表一種代償反應，之后的降低導致了腦脊液糖濃度的降低。
　　3、早產(chǎn)兔發(fā)生重度GM-IVH后，腦組織GLUT3蛋白量有暫時性的增多，是