無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理延遲相中心肌差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分離和鑒定.pdf

1、【目的】
　　采用同位素相對標(biāo)記與絕對定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術(shù)來研究無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理（Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning，NLIP）延遲相階段心肌全部蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，觀察NLIP延遲相對正常大鼠心肌蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探索NLIP內(nèi)源性效應(yīng)的分子機(jī)制。
　　【方法】

2、>　　將12只雄性SD大鼠隨機(jī)分入預(yù)處理組（NLIP組）和對照組（C組），每組6只。NLIP組用橡皮筋環(huán)扎大鼠右后肢根部，阻斷血流5min，開放再灌注5min，共循環(huán)3次，建立NLIP模型； C組大鼠麻醉后不作預(yù)處理。于NLIP延遲相即24小時后，分別取兩組大鼠左心室心尖部組織50-100mg，液氮保存。每組6個樣本取等質(zhì)量混合為一個起始材料進(jìn)行蛋白抽提。采用iTRAQ技術(shù)經(jīng)蛋白酶解、肽段標(biāo)記、高PH反向分離、反向液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析等

3、步驟檢測NLIP組和C組蛋白表達(dá)譜的差異。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)用Mascot搜索引擎在Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肽段和蛋白質(zhì)的鑒定。用Protein Pilot軟件對報告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行計(jì)算得出蛋白質(zhì)的定量信息。以組間表達(dá)差異Ratio>1.2或Ratio<1/1.2（0.833）且統(tǒng)計(jì)學(xué)P-Value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。利用基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能，用Wolfpsort軟件預(yù)

4、測差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位。最后用Western blot驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白在兩組樣本中的表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】
　　經(jīng)iTRAQ檢測和數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定得到3280個蛋白質(zhì)，其中55個蛋白質(zhì)被認(rèn)定為顯著差異表達(dá)蛋白。NLIP組與C組相比，表達(dá)上調(diào)的蛋白有35個，表達(dá)下調(diào)的蛋白有20個。通過對差異表達(dá)蛋白的GO注釋及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及線粒體中，廣泛參與代謝、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)及信