阻斷缺血后處理大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學的研究.pdf

1、目的:通過研究5-羥葵酸阻斷缺血后處理大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)的表達變化，尋找心肌缺血再灌注損傷的標識蛋白和保護蛋白，為科研和臨床提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型:雄性SD大鼠(N=24)隨機分為正常組(Nor)、缺血再灌注損傷組(I/R)、缺血后處理組(IPO)、5-羥葵酸阻斷缺血后處理組(5-HD+IPO)，每組6只;
　　 各組灌注方案:Nor組:持續(xù)

2、灌注Kerbs-Henseleit緩沖液(K-H液)120 min。I/R、IPO及5-HD+IPO組于缺血前灌注K-H液平衡20 min，灌注4℃St.Thomas停跳液缺血40 min，而后分別按以下方案續(xù)灌:I/R組:灌注K-H液60 min; IPO組:復灌前給予K-H液復灌10s、停灌10s循環(huán)6次，繼而K-H液58 min;5-HD+IPO組:復灌前依次灌注100μmol/L5-羥葵酸3min、K-H液復灌10s停灌10s循

3、環(huán)6次、K-H液55 min。記錄各組平衡末和續(xù)灌末心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVDEP)以及最大dp/dt等心功能的變化，并收集心室肌組織;
　　 2.差速離心聯(lián)合Nycodenz密度梯度離心獲取大鼠心肌線粒體，通過透射電鏡檢測線粒體的純度、完整性和富集度;
　　 3.對IPO與5-HD+IPO組心肌線粒體蛋白行雙向凝膠電泳(2-DE)，掃描獲取數(shù)字化圖像，采用PD-Quest8.0軟件查找差

4、異表達蛋白點，并將蛋白點挖取進行質(zhì)譜分析后獲得蛋白相關(guān)信息;
　　 4.利用Western blot回復驗證關(guān)鍵差異蛋白的表達趨勢，以判斷2-DE結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果:
　　 1.透射電鏡證實Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心法使線粒體的純度進一步提高;
　　 2.各組心功能指標在平衡末無明顯差異，灌注末Nor組及IPO組的心功能明顯好于I/R組和5-HD+IPO組（P＜0.05），5-HD+IPO

5、組與I/R組間心功能差異無統(tǒng)計學意義;
　　 3.兩組蛋白進行雙向電泳、圖像掃描、軟件分析后得到表達差異在2倍以上的蛋白點5個，質(zhì)譜分析成功獲得差異蛋白信息;
　　 4.通過分析，在5-HD+IPO組有2個蛋白表達升高:SSP6804(線粒體內(nèi)膜蛋白IMMT)、 SSP7803（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75，Grp75），表達下降的3個蛋白分別為SSP1609（二氫硫辛酸脫氫酶，丙酮酸脫氫酶復合體組成部分，DLDH）、SSP210

6、7(rCG44606)、SSP3002（ATP合酶，ATPsynthase）。
　　 5.Western blot驗證DLDH、Grp75在兩組中的表達情況，在5-HD+IPO組中DLDH較IPO組下降，Grp75較IPO組上升，這些表達變化與2-DE的結(jié)果一致且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺血后處理能明顯改善大鼠心臟功能，而5-羥葵酸可部分阻斷其保護作用;
　　 2.5-

7、HD阻斷缺血后處理后:
　　 ①DLDH表達下調(diào)，推測缺血再灌注損傷激活PDK(丙酮酸脫氫酶激酶)促使DLDH磷酸化而下調(diào);
　　 ②ATP合酶表達下調(diào)，其原因可能是膜電位的改變致使ATP合酶亞基的旋轉(zhuǎn)過程受損;
　　 ③Grp75表達上調(diào)，推測可能是線粒體Ca2+超載、活性氧的生成增加等因素激活了熱休克轉(zhuǎn)錄因子，促進rp75的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達;
　　 ④IMMT表達上調(diào)，可能是由于線粒體內(nèi)H+增加、A