自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、心肌肥厚是高血壓常見的靶器官損害，同時(shí)也是心肌梗死、心衰和猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。心肌肥厚常伴有能量代謝障礙。近年來，研究發(fā)現(xiàn)心肌能量代謝的改變也參與心肌肥厚的形成。作為心臟能量代謝的主要場所，線粒體在高血壓及心肌肥厚中的作用和機(jī)制的研究是一個(gè)熱點(diǎn)問題。同時(shí)線粒體還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞增生、分化及死亡。結(jié)合線粒體分離純化技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)成為高通量、規(guī)模化、整體化研究某一生理或病理狀態(tài)下線粒體所有蛋白質(zhì)的有力工具，為從蛋白水平詮釋線粒體功能

2、及其在疾病中的作用機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)和思路。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是最常用的高血壓模型，其心肌肥厚的發(fā)生不僅和機(jī)械因素(血壓)有關(guān)，還和其遺傳背景造成的生化因素有關(guān)。比較血壓升高前后SHR心肌組織的線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)將有助于分析該模型致心肌肥厚的病理因素，揭示線粒體在高血壓病心肌肥厚的作用和機(jī)制。 雙向熒光差異凝膠電泳(two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE)

3、是一種新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比經(jīng)典的雙向電泳(2-DE)具有更高的動(dòng)力學(xué)范圍和靈敏性，是在蛋白質(zhì)組水平進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析的有力工具。我們選取血壓正常期(4周齡)和血壓升高期(20周齡)的SHR大鼠和年齡與之相匹配的對(duì)照WKY大鼠，以及降壓藥氯沙坦干預(yù)8周的28周齡SHR和未處理的28周齡SHR，應(yīng)用差速離心和不連續(xù)密度梯度離心方法抽提左心室組織的線粒體，經(jīng)2D-DIGE分離蛋白，電泳結(jié)果分別用3種不同的激發(fā)波長得到不

4、同顏色的熒光信號(hào)，根據(jù)這些信號(hào)的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。通過制備預(yù)制膠，尋找蛋白表達(dá)差異點(diǎn)，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF MS)分析鑒定蛋白。 基于2D-DIGE的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示4周齡SHR左室心肌組織線粒體蛋白就已發(fā)生改變，此時(shí)血壓尚未升高，但心肌已出現(xiàn)肥厚。其中共有33個(gè)差異點(diǎn)，17個(gè)點(diǎn)下調(diào)，16個(gè)點(diǎn)上調(diào)。這種改變?cè)诟哐獕喊l(fā)生后的20周齡SHR的左室心肌中卻不明顯，甚

5、至部分點(diǎn)的差異發(fā)生恢復(fù)，提示線粒體的調(diào)變?cè)缙趨⑴c了心肌肥厚的發(fā)生。33個(gè)差異點(diǎn)中許多被鑒定出是同一種蛋白，提示存在修飾、異構(gòu)體或基因水平的變化。我們共鑒定出17種蛋白，涉及到線粒體的能量代謝如糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和線粒體氧化磷酸化的多種酶和一些分子伴侶、孔道蛋白，提示SHR左室心肌早期就存在線粒體功能障礙，而這些變化可能通過線粒體能量不足而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激參與了SHR心肌肥厚的發(fā)生。藥物的短期干預(yù)并沒有影響差異點(diǎn)的表達(dá)。同時(shí)我們

6、測(cè)定了心肌能量和心功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20周齡的SHR心功能要高于同年齡段的WKY大鼠，提示血壓升高后，肥厚的心肌早期在壓力負(fù)荷刺激下心功能出現(xiàn)代償，甚至是升高，心臟興奮收縮偶聯(lián)需要大量的ATP，線粒體為了適應(yīng)這種變化發(fā)生增殖，可能也是部分能量代謝蛋白回復(fù)的原因。 這些差異蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)其中有兩個(gè)改變比較明顯的蛋白，分別是線粒體三功能酶α亞基(Hadha)和NADH還原酶1α亞單位10(Ndufa10)。Hadha是長鏈脂肪酸β氧化

7、過程中的關(guān)鍵酶，而Ndufa10是呼吸鏈復(fù)合體I的亞基參與了線粒體氧化磷酸化過程，它們都是線粒體能量產(chǎn)生中的重要組分。我們通過蛋白免疫印跡驗(yàn)證了它們?cè)诙S電泳的差異表達(dá)，并且這種改變?cè)?周齡SHR左室心肌也同樣存在，而此周齡段的SHR尚未出現(xiàn)心肌肥厚，提示這些變化是基于SHR大鼠遺傳背景的原發(fā)性變化。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Hadha存在可能的蛋白剪切，且只存在左室心肌中，而Ndufa10的改變?cè)谛呐K各部分及不同的臟器均出現(xiàn)，這種變化經(jīng)基因測(cè)序被證