Sirt3在自發(fā)性高血壓大鼠心肌高表達與左心室肥厚相關.pdf

1、研究目的
　　 沉默信息調節(jié)因子相關酶3(sirtuin3，sirt3)為沉默信息調節(jié)因子2(silentinformationregulator2，SIR2)家族成員之一，定位于線粒體內膜，具有脫乙酰基酶活性。人們發(fā)現(xiàn)這個蛋白參與調控了許多細胞進程，如細胞代謝、細胞周期、細胞凋亡、細胞分化及細胞壽命等。Sirt3增加表達與延長人類的壽命有關。近年來，越來越多的研究集中在它與心血管疾病的關系上。目前，對于sirt3與高血壓所致左

2、心室肥厚的關系尚不明確。本研究旨在觀察sirt3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌中的表達，并探討sirt3在高血壓所致左心室肥厚(leftventricularhypertrophy，LVH)中的作用。
　　 方法
　　 1.實驗動物和設計
　　 選擇29周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)26只，隨機分為SHR30周組（喂養(yǎng)1周）和SHR38周組（喂養(yǎng)9周）;另選同齡Wistar—Kyoto(WKY)大鼠20只，隨機

3、分為WKY30周組（喂養(yǎng)1周）和WKY38周（喂養(yǎng)9周）作為正常對照。分批于30周及38周處死。各組測定尾動脈收縮壓和左心室質量/體質量(LVM/體質量)。留取心尖（約1/2左心室）的部分，錫鉑紙包裹后液氮冷凍，-80℃冰箱保存已備做qRT-PCR及Western用。余1/2左心室組織經過4％多聚甲醛固定48小時后，進行石蠟包埋以備用于免疫組織化學染色。
　　 2.超聲心動圖測量
　　 PHILIPS公司IE33心臟超聲

4、儀，選S12-5超聲探頭，頻率約5MHz，測量左室舒張末期內徑(LVEDd)，左室收縮末期內徑(LVESd)，舒張末期左室后壁厚度(LVPWD)，舒張末期室間隔厚度(IVSD)，左室短軸縮短率(LVFS)以評價心臟的結構和功能。
　　 3.Masson染色
　　 切片常規(guī)脫蠟至水，Masson三色染色試劑盒進行染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。并采用全自動圖像分析系統(tǒng)，在光鏡下隨機選取5個視野，測量心肌組織膠

5、原容積積分(CVF)。CVF=膠原面積/總面積（其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積）。
　　 4.免疫組織化學染色
　　 取組織切片，進行sirt3的免疫組織化學染色，每只實驗動物選取5張切片，隨機分析3個視野，圖像采用Image-ProExpress6.0軟件分析蛋白表達量，結果以累積光密度值表示。
　　 5.Westernblot法顯示組織中蛋白的表達
　　 將-80℃保存的組織，先進行總蛋白的提取，

6、然后用BCA法測定蛋白的濃度，再按常規(guī)方法配分離膠和濃縮膠，電泳、轉膜、封閉、一抗過夜、二抗孵育、曝光、顯影、定影，條帶用Image-ProExpress6.0軟件分析灰度值。
　　 6.實時定量多聚酶鏈反應(qRT-PCR)
　　 Trizol法提取總的RNA，然后逆轉錄mRNA至cDNA，用Premer5.0設計sirt3的特異引物，以GAPDH基因做內參照，熒光定量PCR檢測sirt3的mRNA的相對表達。

7、　　 7.統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均值±標準差(x±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗，直線相關(Person相關)分析用以研究兩變量之間的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.實驗中2只SHR大鼠死亡，均為SHR38周組，最終44只完成實驗。其中SHR30周組11只，SHR38周組13只，對照組WKY大鼠2

8、0只。
　　 2.與WKY對照組大鼠比較，SHR組的收縮壓、LVM/體質量、左室收縮末期內徑、舒張末期室間隔厚度、舒張末期左室后壁厚度、CVF、sirt3mRNA和蛋白表達均明顯升高（均P＜0.05）;左室短軸縮短率、左室舒張末期內徑均明顯降低（均P＜0.05)，SHR大鼠表現(xiàn)出明顯的左心室肥厚，左心室收縮及舒張功能明顯減低，隨著周齡的延長，心肌肥厚及心功能障礙明顯加重(均P＜0.05)。
　　 3.把SHR心肌sirt