去腎交感神經(jīng)對自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的影響.pdf

1、一、研究背景
　　 長期高血壓所致的左心室肥厚(LVH)是高血壓病人不良心血管預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、腦卒中和猝死的獨立危險因素。盡管LVH主要與血壓升高的程度和時間相關(guān)，但是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和交感神經(jīng)的激活，在LVH的發(fā)生和發(fā)展中也起著極其重要的作用。
　　 應(yīng)用藥物抑制交感神經(jīng)和RAAS的過度激活可逆轉(zhuǎn)心室肥厚，但需要長期服用，并存在藥物副反應(yīng)。近年來的臨床研究結(jié)

2、果顯示，去腎交感神經(jīng)治療頑固性高血壓療效安全顯著。去腎交感神經(jīng)后去甲腎上腺素流溢率下降，提示腎交感傳出神經(jīng)釋放去甲腎上腺素減少。這表明去腎交感神經(jīng)可能有效的抑制了交感神經(jīng)和RAAS的過度激活，并且有可能通過降低血壓，以及抑制交感神經(jīng)和RAAS的過度激活，從而減輕或逆轉(zhuǎn)高血壓引起的心肌肥厚。
　　 本研究通過對自發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行去腎交感神經(jīng)術(shù)，應(yīng)用對大鼠心臟的病理切片進(jìn)行HE染色、masson染色，對大鼠心臟用定量PCR進(jìn)行肥厚

3、標(biāo)志分子檢測等方法，探討去腎交感神經(jīng)對高血壓大鼠左心室肥厚的作用及其機(jī)制。
　　 二、材料和方法
　　 （一）高血壓大鼠去腎交感神經(jīng)模型的制備與分組
　　 1、分組
　　 將月齡為6個月的雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)30只隨機(jī)分為3組:(1)假手術(shù)組，n=10;(2)去腎交感神經(jīng)組，n=10;(3)培哚普利組，n=10（用灌胃的方式，按1 mg/kg·d，連續(xù)給藥50天）。
　　 2、模型

4、>　　 適應(yīng)環(huán)境一周后，大鼠用10％水合氯醛(0.03-0.05ml/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，行腹正中切口，暴露雙側(cè)腎的腎動脈和腎靜脈。在解剖顯微鏡下，將可見的腎神經(jīng)、脂肪和結(jié)締組織從腎血管剝離。以10％的苯酚酒精溶液涂在腎血管上，確保破壞所有的殘留神經(jīng)，將內(nèi)臟復(fù)位后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組大鼠用10％水合氯醛(0.03-0.05ml/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，行腹正中切口，暴露雙側(cè)腎的腎動脈和腎靜脈后，將內(nèi)臟復(fù)位后關(guān)閉腹腔。
　　

5、3、術(shù)后評價和觀察指標(biāo)的選擇
　　 (1)用電刺激神經(jīng)的方法來驗證去腎交感神經(jīng)的完整性。(2)自去腎交感神經(jīng)手術(shù)當(dāng)日起，每10天稱體重一次，至處死前一天。(3)自去腎交感神經(jīng)手術(shù)當(dāng)日起，每10天進(jìn)行一次尾動脈無創(chuàng)血壓測量，至處死前一天。每只大鼠每次在靜息狀態(tài)下重復(fù)測量血壓15次，取平均值，并繪制大鼠血壓波動曲線。
　　 （二）大鼠心室重/體重比
　　 麻醉SHR大鼠后稱重，開胸取心臟，PBS清洗，去除游離組織及心

6、房，稱心室質(zhì)量，計算心室重/體重比。
　　 （三）大鼠左心室形態(tài)及心肌組織的分析
　　 1、大鼠左心室形態(tài)的觀察
　　 麻醉SHR大鼠后，開胸取心臟，PBS清洗，稱左右心室質(zhì)量，取左室心肌組織約100mg，預(yù)冷的PBS漂洗后，組織勻漿或液氮研磨，加入1ml Trizol，余組織固定于4％多聚甲醛備用。組織經(jīng)水沖洗清除固定液，濃度梯度乙醇依次脫水，二甲苯去除酒精，使組織塊透明;浸蠟2-3h，將浸透好的樣本切面向下放

7、入含有石蠟的包埋器內(nèi)，靜置。石蠟包埋的組織塊切片，切好的蠟帶，放到40℃左右的溫水中展平，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片。后分別對大鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行HE染色，觀察左心室形態(tài)學(xué)變化。
　　 2、心肌細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞直徑
　　 40倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的變化。每組分別隨機(jī)選取10個視野中的200個細(xì)胞，計算細(xì)胞直徑，進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 3、心肌纖維化的觀察和評估
　　 對石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行masson三

8、色染色。在40倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選擇20個區(qū)域觀察masson染色的大鼠心肌纖維化改變，計算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)來評估心肌纖維化程度，膠原容積分?jǐn)?shù)使用表面染成藍(lán)色的膠原面積除以心肌表面積，用百分比表示。
　　 （四）心肌肥厚相關(guān)標(biāo)志分子的檢測
　　 大鼠左室心肌組織約100mg，Trizol裂解后，加氯仿劇烈混勻靜置后離心，取上層水相加異丙醇沉淀RNA，離心后可見白色的RNA斑塊。75％乙醇清洗RNA沉淀斑塊后，以無

9、RNA酶的水溶解干燥后的RNA斑塊。10倍稀釋后行濃度測定與凝膠電泳對RNA樣品進(jìn)行質(zhì)控分析。
　　 取500ng的RNA樣品，利用oligo dt和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。適當(dāng)稀釋后，以目的基因的引物進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，通過溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定基因擴(kuò)增的特異性，以GAPDH基因為內(nèi)參，利用△△Ct分析樣品間目的基因的相對表達(dá)水平。
　　 三、實驗結(jié)果
　　 （一）自發(fā)性高血壓大鼠體

10、重的變化
　　 術(shù)前三組SHR大鼠的體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異，術(shù)后各組大鼠的體重凈增加值無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示去腎交感神經(jīng)術(shù)對大鼠的生長無影響。
　　 （二）自發(fā)性高血壓大鼠無創(chuàng)血壓變化趨勢
　　 各組大鼠的起始血壓無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。假手術(shù)組的SHR大鼠血壓逐步緩慢升高，末次血壓達(dá)到（219.60±2.01）/（163.50±3.84）mmHg;去腎交感神經(jīng)組在術(shù)后20天內(nèi)血壓顯著下降(P＜0.0

11、5)，隨后血壓平穩(wěn)波動，末次血壓輕度升高，實驗結(jié)束時血壓達(dá)到（158.10±2.51）/（97.10±3.41）mmHg，相對于假手術(shù)組，血壓下降具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與培哚普利組相比較，去腎交感神經(jīng)組大鼠在10d、20d、30d的收縮壓都較低（172.70±3.23mmHg vs.178.60±2.91mmHg、156.30±2.63mmHg vs.162.80±2.46mmHg、151.60±1.90mmHg vs.156

12、.00±2.31 mmHg），具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);而第40天兩者之間的收縮壓無統(tǒng)計學(xué)差異（153.80±1.69mmHg vs.151.20±1.23mmHg，P＞0.05）;第50天去腎交感神經(jīng)組大鼠的血壓出現(xiàn)升高，高于培哚普利組大鼠的血壓（158.10±2.51mmHg vs.154.50±2.37mmHg，P＜0.05）。與培哚普利組相比較，去腎交感神經(jīng)組大鼠在10d、20d、30d的舒張壓都較低(109.70±3.1

13、3mmHg vs.120.10±3.48mmHg、96.10±4.30mmHg vs.106.80±3.49mmHg、90.90±3.73mmHg vs.99.70±3.34mmHg，P＜0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)差異;而第40、50天兩者之間的舒張壓無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示去腎交感神經(jīng)術(shù)可以顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓。
　　 （三）心室重/體重比
　　 去腎交感神經(jīng)組的大鼠心室重/體重比值(VW/BW)顯著低

14、于假手術(shù)組（3.56±0.27mg/g vs.5.03±0.31 mg/g，P＜0.05），與培哚普利組（3.56±0.27 mg/g vs.3.85±0.30 mg/g,P＞0.05）無統(tǒng)計學(xué)差異，提示去腎交感神經(jīng)術(shù)可以抑制心肌肥厚進(jìn)程。
　　 （四）SHR心肌肥厚組織形態(tài)學(xué)分析
　　 1、心臟及心肌細(xì)胞組織形態(tài)
　　 通過HE染色發(fā)現(xiàn)去腎交感神經(jīng)組大鼠左心室室壁較假手術(shù)組薄，心腔較假手術(shù)組大;但與培哚普利組大

15、鼠無顯著差異。
　　 顯微鏡下觀察可見，與假手術(shù)組相比，去腎交感神經(jīng)組大鼠心肌水腫程度較輕，心肌纖維走行較整齊，心肌細(xì)胞排列較整齊，體積較小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰;但與培哚普利組比較，心肌水腫程度，心肌纖維的走行，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列，以及心肌細(xì)胞的大小均無顯著差異。隨機(jī)選取10個視野中的200個細(xì)胞，計算細(xì)胞直徑，去腎交感神經(jīng)組心肌細(xì)胞直徑明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)，與培哚普利組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示去腎交感神經(jīng)術(shù)可以

16、抑制心肌細(xì)胞肥大。
　　 2、膠原蛋白含量
　　 用masson三色染色心肌組織來評估心肌的纖維化，纖維組織被染成藍(lán)色，心肌細(xì)胞為紅色。膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)來評估心肌纖維化程度，用百分比表示。結(jié)果顯示去腎交感神經(jīng)組大鼠心臟CVF為(9.39±0.98％)，明顯低于假手術(shù)組的(20.99±1.40％，P＜0.05)和培哚普利組的（10.48±0.93％，P＜0.05）。提示去腎交感神經(jīng)術(shù)可以抑制心肌纖維化進(jìn)程。
　

17、　 （五）心肌肥厚標(biāo)記基因的表達(dá)分析
　　 心房鈉尿肽（ANP）、β-重鏈肌球蛋白(β-MHC)、α-重鏈肌球蛋白(a-MHC)基因的分子表達(dá)水平可以間接反映心肌肥厚和損傷的程度。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，去腎交感神經(jīng)組大鼠心臟組織中ANP和β-MHC基因的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.05)，但與培哚普利組無明顯差異(P＞0.05);同時去腎交感神經(jīng)組的α-MHC表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組和培哚普利組(P＜0.05)。