pEGFP介導(dǎo)的ING4基因?qū)251細(xì)胞株增殖及凋亡的影響.pdf

1、一、研究背景 膠質(zhì)瘤是一種最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的40％—60％，年發(fā)病率為10/10萬(wàn)，絕大多數(shù)惡性程度較高，預(yù)后較差。惡性膠質(zhì)瘤平均存活期僅為9-12個(gè)月，5年生存率低于5.5％。惡性膠質(zhì)瘤由于其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易于復(fù)發(fā)，所在區(qū)域功能重要等原因，治療效果很不理想。目前膠質(zhì)瘤的治療仍然是以手術(shù)切除為主，輔以放療化療的綜合治療。在膠質(zhì)瘤的臨床基礎(chǔ)研究方面，基因治療仍然是研究的熱點(diǎn)?；蛑委熤饕扇齻€(gè)核心部分組成，

2、即目的基因、基因載體系統(tǒng)和基因表達(dá)系統(tǒng)。選擇有效的轉(zhuǎn)移基因顯然是取得良好治療效果的最重要因素。 膠質(zhì)瘤的病因迄今為止尚未完全明確，是一個(gè)涉及多基因的過(guò)程，主要與遺傳因素、胚胎發(fā)育因素、物理化學(xué)因素、病毒感染因素等密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及癌基因的活化和抑癌基因的失活、細(xì)胞的瘤變、凋亡抵抗、自主生長(zhǎng)信號(hào)的產(chǎn)生、新生血管的出現(xiàn)、免疫逃避、侵襲性的獲得等等。抑制膠質(zhì)瘤增殖、細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤凋亡以及抑制膠質(zhì)瘤血管生成是膠質(zhì)

3、瘤治療的主要方法和途徑，相關(guān)基因也是基因治療研究的重點(diǎn)。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)抑制因子4(ING4)基因在抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤凋亡、恢復(fù)細(xì)胞間的接觸抑制、影響細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感性等方面有重要作用。ING4基因定位于12p13.31，由8個(gè)外顯子與七個(gè)內(nèi)含子組成，大小約13000個(gè)bp，人的ING4基因ORF長(zhǎng)度為747bp，編碼約249個(gè)氨基酸殘基，具有核定位信號(hào)以及C末端高度保守的PH

4、D鋅指結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，ING4表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度成反比，不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤的ING4表達(dá)具有明顯差異。這說(shuō)明ING4基因可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因此研究ING4基因?qū)δz質(zhì)瘤的治療作用及其機(jī)制具有重要意義。ING4基因是否能抑制膠質(zhì)瘤增殖、誘導(dǎo)其凋亡目前需要解決的首要問(wèn)題。 目前，廣泛使用的基因表達(dá)系統(tǒng)之一是pEGFP質(zhì)粒，pEGFP質(zhì)粒含有GFP基因和卡那霉素/新霉素抗性基因，能在真核細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白GFP

5、和卡那霉素/新霉素抗性。因此，在轉(zhuǎn)染后，可以通過(guò)G418篩選和GFP流式細(xì)胞分選系統(tǒng)篩選，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)染株。構(gòu)建攜帶ING4的真核表達(dá)載體是研究該基因功能的基礎(chǔ)。pEGFP質(zhì)粒介導(dǎo)的目的基因可以實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中的高表達(dá)，從而達(dá)到基因治療的目的。 二、研究目的 1.構(gòu)建攜帶ING4基因的真核表達(dá)載體pEGFP—ING4； 2.pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染U251，篩選陽(yáng)性克?。?3.分析ING4在pEGFP—IN

6、G4轉(zhuǎn)染的U251中的表達(dá)； 4.探討pEGFP—ING4對(duì)U251細(xì)胞株的增殖、凋亡的影響； 三、實(shí)驗(yàn)方法 1.生物信息學(xué)分析ING4基因：運(yùn)用ORF Finder、TargetP、TMpred、SignalP、Conserved Domains在線軟件對(duì)ING4進(jìn)行開放讀碼框分析、亞細(xì)胞定位分析、跨膜區(qū)分析、信號(hào)肽分析、結(jié)構(gòu)域分析。 2.重組質(zhì)粒pEGFP—ING4的構(gòu)建：①運(yùn)用Premier Pri

7、mer5、PCR design軟件設(shè)計(jì)ING4的引物。②從人胎盤組織中提取總RNA，通過(guò)RT—PCR獲得cDNA，PCR釣取目的基因。③TA克隆，將目的片段連接到pGEM—T載體上，轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，酶切鑒定。④雙酶切陽(yáng)性TA克隆質(zhì)粒和pEGFP載體，電泳后切膠回收。將目的片段和pEGFP載體連接，轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序鑒定。 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性克隆的篩選：pEGFP質(zhì)粒和pEGFP—ING4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U25

8、1。運(yùn)用G418(800μg/ml)篩選法、流式細(xì)胞分析分選系統(tǒng)分選法篩選GFP陽(yáng)性及卡那霉素/新霉素抗性U251細(xì)胞。pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性組，pEGFP轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染組為空白實(shí)驗(yàn)組。 4.分析ING4在各組細(xì)胞中的表達(dá)：運(yùn)用免疫組化法分析上述三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ING4的表達(dá)；運(yùn)用western—blot法檢測(cè)上述三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組ING4蛋白的表達(dá)和內(nèi)參beta—actin的表達(dá)，用Image—Pro P

9、lus6.0軟件分析條帶的光密度值。 5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)：用MTT、法檢測(cè)上述三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖，統(tǒng)計(jì)各組OD492值。用Hochest染色法分析上述三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡數(shù)，并計(jì)算凋亡率。 6.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS軟件。三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組的光密度值、OD492值、凋亡率均采用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果 1.重組質(zhì)粒pEGFP—ING4的鑒定：pEGF

10、P—ING4質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切后，電泳發(fā)現(xiàn)在10000bp附近和1000bp附近各有一條熒光條帶，其長(zhǎng)度和pEGFP以及ING4相符。pEGFP—ING4經(jīng)過(guò)測(cè)序分析后比對(duì)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基突變。 2.ING4各組中的表達(dá)：①免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞有棕黃色著色，細(xì)胞核著色較深，其他兩組細(xì)胞未見(jiàn)棕黃色著色。②western—blot分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染組在30KD附近有一條條帶，與ING4分子量相一

11、致，其光密度值高于其他兩組，P<0.05；pEGFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組30KD附近的光密度值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；各組在30 KD最上方均有一條內(nèi)參beta—actin的條帶，各組光密度值的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 3.MTT實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種后第1天、第3天、第5天，pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染組的OD492呈下降趨勢(shì)。pEGFP—ING4轉(zhuǎn)染組的U251在接種后第3和第5天的OD492低于pEGFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染