JNK抑制劑及RNA干擾核仁素對U251細胞增殖與凋亡的影響研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治愈率低的特點，目前對其病因、發(fā)病機制及生物學(xué)特性的深入探討以及尋找新的治療策略，是亟待解決的熱點和難題。基因治療能針對腫瘤組織中特有的基因變異進行修復(fù)或促使腫瘤細胞凋亡，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于腦內(nèi)的神經(jīng)元和大部分其它細胞為靜止期細胞，分裂活躍的細胞主要為腫瘤細胞，因此，惡性腦膠質(zhì)瘤的基因治療的靶目標(biāo)性強。核仁素（NCL）是真核細胞核仁中一種多功能磷酸蛋白，其表達水

2、平與細胞分裂的速率呈正相關(guān)，常被用來作為腫瘤細胞增殖程度的一種非特異性指標(biāo)。
　　目的：通過RNA干擾核仁素和應(yīng)用JNK抑制劑SP600125，觀察對U251細胞增殖和凋亡的影響，探討其可能機制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療新途徑的研究提供實驗基礎(chǔ)和科學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法：
　　(1)采用濃度為10,20,30,40,50μM的JNK抑制劑SP600125分別處理人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞0h,24h,48h和72h，

3、利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞增殖水平，取合適值作為實驗濃度進行Western blot和Immunocytochemistry檢測P-c-jun和核仁素蛋白表達水平。
　　(2)將核仁素干擾質(zhì)粒：NCL-234，NCL-1509，NCL-1732，NCL-1825和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入U251細胞，然后采用real-time PCR和Western blot方法分別檢測核仁素的mRNA和蛋白水平表達情況，篩選出有效干擾質(zhì)粒。

4、
　　(3)將實驗分為轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒對照組、RNA干擾核仁素組、轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒聯(lián)合JNK抑制劑處理組和干擾聯(lián)合JNK抑制劑組，進行Western blot檢測相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2，bax的表達變化。
　　結(jié)果：
　　(1)MTT結(jié)果顯示，不同濃度SP600125分別處理細胞24,48,72h后，處理組U251細胞與對照組相比，培養(yǎng)24h時各組之間細胞的增殖沒有明顯變化，48h之后當(dāng)濃度大于40μM時SP600125對細胞

5、的抑制作用明顯增強，隨著SP600125濃度增加和作用時間延長，細胞增殖抑制越明顯，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性；Western blot檢測顯示P-c-jun和核仁素蛋白表達呈相同下調(diào)趨勢；免疫熒光檢測核仁素發(fā)生明顯的從胞核向胞漿的移位，Hoechst33242染核后熒光顯微鏡觀察表明，JNK抑制劑處理48h之后，部分細胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征，如核體積變小、固縮，部分細胞核裂解為碎塊，呈致密濃染的顆粒狀熒光。
　　(2)

6、熒光顯微鏡觀察，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入U251細胞；real-time PCR、Western blot結(jié)果顯示，干擾質(zhì)粒能不同程度下調(diào)NCL mRNA水平及其蛋白表達，其中干擾質(zhì)粒NCL-234作用效果最為顯著。
　　(3)結(jié)果顯示，RNA干擾核仁素組，轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒聯(lián)合JNK抑制劑處理組，干擾聯(lián)合JNK抑制劑處理組與轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組相比，細胞凋亡明顯，Bcl-2表達不同程度減少，Bax表達則相應(yīng)增高。
　　結(jié)論：
　　(1)JN