BTBD10在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對U251細(xì)胞株增殖和凋亡的影響.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，統(tǒng)計(jì)資料表明其發(fā)生率約占顱內(nèi)腫瘤的40-50％，其多呈浸潤性生長，與正常腦組織間常無明顯分界，易侵犯重要神經(jīng)結(jié)構(gòu)，難以做到手術(shù)完全切除，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率、病死率高。而藥物化療和放射治療不能高度特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，并且可能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，目前腦膠質(zhì)瘤仍為神經(jīng)外科領(lǐng)域的難治性疾病，而闡明其發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療手段成為神經(jīng)外科的研究熱點(diǎn)。
　　 和其他部位腫瘤一樣，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生

2、、發(fā)展是一個非常復(fù)雜的過程，涉及多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)異?；蚴Щ?。膠質(zhì)痛本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，其發(fā)生是由于原癌基天的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常、細(xì)胞循環(huán)周期的改變、生命周期的延長以及細(xì)胞調(diào)亡缺陷等，從而出現(xiàn)細(xì)胞增殖失控及惡性轉(zhuǎn)化。與腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)的細(xì)胞通路主要有磷脂酰肌醇3一激醇(PI3K)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因，在

3、此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)、新策略，是神經(jīng)外科研究領(lǐng)域的主要內(nèi)容之一。
　　 BTBD10基因含BTB/POZ功能域，位于人染色體的11p15.2區(qū)域，全長2551bp，含245-16721bp開放閱讀框架，編碼475氨基酸的蛋白，蛋白分子量51.7Kd。前期研究在對18例腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行表達(dá)譜芯片篩選及聚類分析中發(fā)現(xiàn)：芯片數(shù)據(jù)提示BTBD10表達(dá)量在各級別膠質(zhì)瘤中均發(fā)生下調(diào)，平均Ratio值為0.218?；虮磉_(dá)譜Hierar

4、chical聚類發(fā)現(xiàn)與BTBD10表達(dá)譜相近的基因有：血管性腸肽(VIP)、腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白(TP53BP1)、β淀粉樣蛋白前體(APBB1)、8氧化鳥嘌呤糖基酶(OGG1)、促性腺素誘導(dǎo)阻抑蛋白(GIOT1)、MADS轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子2C(MEF2C)。MTC為模板RT-PCR結(jié)果顯示BTBD10在檢測的8種正常組織中，腦組織中高表達(dá)，而心、肺、肝、腎、胰腺組織中表達(dá)量較低。Northern雜交結(jié)果顯示BTBD10在正常成人腦組織中表

5、達(dá)量高，在7例不同級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)量都下降，BTBD10在膠質(zhì)瘤/正常腦組織的表達(dá)量比率與芯片數(shù)據(jù)基本相符。在肝癌、卵巢癌和肺癌中BTBD10的表達(dá)沒有顯著性差異。提示BTBD10基因與腦膠質(zhì)瘤高度相關(guān)，有可能成為新的腦膠質(zhì)瘤治療靶基因。為進(jìn)一步研究BTBD10基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過檢測BTBD10在大樣本膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，培養(yǎng)過表達(dá)BTBD10基因的細(xì)胞株，初步探討B(tài)TBD10基因調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖水平的可能機(jī)制。

6、
　　 第一部分 BTBD10在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義
　　 目的：探討B(tài)TBD10mRNA和BTBD10蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義。
　　 方法：采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot雜交檢測BTBD10mRNA和BTBD10蛋白在正常腦組織和各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，分析其表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系。
　　 結(jié)果：在正常腦組織中BTBD10mRNA和蛋白的表達(dá)較高；各級別膠質(zhì)瘤中的表

7、達(dá)均低于正常腦組織(P＜0.05)；在低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ-Ⅱ級)中表達(dá)量較低，而在高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ-Ⅳ)中表達(dá)水平更低，低級別和高級別之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。BTBD10mRNA和蛋白的表達(dá)水平與年齡、性別、病理類型等臨床病理特征無明顯相關(guān)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：膠質(zhì)瘤中BTBD10表達(dá)明顯低于正常腦組織中的表達(dá)，且隨病理級別的增高而降低，提示BTBD10在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并與膠質(zhì)瘤的病

8、理分級密切相關(guān)。
　　 第二部分BTBD10過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定
　　 目的：構(gòu)建BTBD10慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。
　　 方法：以BTBD10基因?yàn)槟０錚CR擴(kuò)增目的基因，表達(dá)載體(pLV-UbC-GFP-3FLAG)酶切后進(jìn)行膠回收載體片段，目的基因與載體片段同源重組后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆測序鑒定，質(zhì)粒抽提，與無內(nèi)毒素病毒包裝質(zhì)粒、膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染29

9、3T細(xì)胞包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，測定慢病毒滴度。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果均證實(shí)，插入序列完全正確，包裝病毒產(chǎn)生病毒懸液的滴度為3.42×108TU/ml。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶BTBD10基因的慢病毒載體，為研究其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能和以其為靶點(diǎn)的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分 BTBD10慢病毒載體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251及其作用機(jī)制研究
　　 目的：了解BTBD10重組慢病毒載

10、體轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251后，對U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討其發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用的機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用BTBD10慢病毒載體、空載體分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，正常培養(yǎng)U251細(xì)胞作為空白對照。熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后BTBD10和CyclinD1 mRNA的表達(dá)變化，Western blot雜交檢測BTBD10、磷酸化Akt(pAkt)和CyclinD1蛋白水平變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡水平，

11、MTT法分析細(xì)胞增殖情況并繪制生長曲線。
　　 結(jié)果：熒光定量PCR和Western blot雜交結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空白載體的U251細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染重組BTBD10病毒載體的U251細(xì)胞中BTBD10mRNA和蛋白水平明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Akt的磷酸化水平下調(diào)，CyclinD1 mRNA和蛋白水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡水平，檢測結(jié)果表明

12、，與未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空白載體的U251細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染BTBD10的U251細(xì)胞中凋亡細(xì)胞明顯增多，早期凋亡細(xì)胞達(dá)14.64％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P＜0.05)；細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的U251細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞狀態(tài)基本相同，部分細(xì)胞處于G2/M期，轉(zhuǎn)染BTBD10病毒載體的U251細(xì)胞則被明顯的抑制在G0/G1期，提示增殖活性降低。MTT法檢測細(xì)胞增值率，發(fā)現(xiàn)外源性BTBD10基因轉(zhuǎn)染U251細(xì)