重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因?qū)ξ赴┒嗨幠退幖?xì)胞株SGC7901-CDDP耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.建立順鉑耐藥型胃癌細(xì)胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml),為研究胃癌化療多藥耐藥提供細(xì)胞基礎(chǔ);2.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4(inhibitor of growth4,生長抑制因子4)基因表達(dá)對(duì)胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/CDDP的耐藥逆轉(zhuǎn)效果和潛在分子機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　一、順鉑耐藥型胃癌細(xì)胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)的建立和其多藥耐藥特性的鑒定
　　應(yīng)

2、用逐步增加培養(yǎng)基中順鉑(Cisplatin, CDDP)濃度(從0.05ug/ml至2ug/ml)持續(xù)作用的方法誘導(dǎo)親本敏感胃癌細(xì)胞株SGC7901對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥,培養(yǎng)順鉑耐藥型胃癌細(xì)胞株SGC7901/CDDP(2ug/ml)。采用CCK-8法測(cè)定ADM、5-FU和CDDP對(duì)SGC7901/CDDP和 SGC7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50％inhibiting concentration, IC50),確定SGC7901/C

3、DDP的多藥耐藥特性。熒光定量PCR法鑒定SGC7901/CDDP細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的多藥耐藥和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過逐步持續(xù)增加順鉑濃度半年,我們成功培養(yǎng)出順鉑耐藥型胃癌細(xì)胞株。相對(duì)于敏感株SGC7901,其對(duì)CDDP、5-FU和ADM的耐藥倍數(shù)分別為19.92、7.53和6.68。熒光定量PCR結(jié)果顯示:SGC7901/CDDP較SGC7901細(xì)胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表達(dá)升高

4、,而Bax基因表達(dá)明顯降低。
　　二、重組腺病毒介導(dǎo)的人ING4基因表達(dá)對(duì)胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/CDDP的耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究
　　用本實(shí)驗(yàn)室已保存的高純度、高效價(jià)的帶有ING4基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-ING4(100MOI)及空病毒 Ad-GFP(100MOI)感染胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/CDDP,RT-PCR和Western blot法鑒定ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP細(xì)胞中

5、表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究Ad-ING4對(duì)SGC7901/CDDP細(xì)胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果和可能機(jī)制,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分用CCK-8法進(jìn)一步測(cè)定ADM、5-FU和CDDP對(duì)過表達(dá)ING4的SGC7901/CDDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)的變化以及熒光定量PCR法測(cè)定多藥耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和Survivin的表達(dá)變化情況。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分建立SGC7901/CDDP細(xì)胞裸鼠人胃癌移植瘤模型,觀

6、察Ad-ING4介導(dǎo)的ING4表達(dá)在體內(nèi)對(duì)裸鼠人胃癌移植瘤的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。免疫組化法檢測(cè)多藥耐藥和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、Bax、Bcl-2和Survivin的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ING4基因和蛋白在SGC7901/CDDP細(xì)胞中成功表達(dá), CCK-8法顯示CDDP、5-FU和ADM對(duì)過表達(dá)ING4的SGC7901/CDDP細(xì)胞的IC50明顯減低,耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為9.86、4.09和2.23;熒光定量PCR顯示過表達(dá)I

7、NG4后SGC7901/CDDP細(xì)胞MDR1、MRP1、Bcl-2和Survivin基因表達(dá)顯著降低,而Bax基因表達(dá)明顯升高;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Ad-ING4治療后移植瘤生長明顯受到抑制,具有明顯的抑瘤增敏效應(yīng),進(jìn)一步免疫組化顯示Ad-ING4能明顯降低P-gp、MRP1、Bcl-2、Survivin蛋白的表達(dá)和升高Bax蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.通過體外連續(xù)誘導(dǎo)胃癌親本細(xì)胞SGC7901成功獲得2ug/ml的順鉑