土槿皮乙酸逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901-ADR細(xì)胞耐藥的作用機(jī)制.pdf

1、目的:化學(xué)治療是中晚期胃癌患者治療的主要手段。但是，由于腫瘤耐藥的發(fā)生，化療藥物的療效不能夠有效發(fā)揮。土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是從土槿皮——松科植物金錢松(Pseudolarix kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根樹皮中分離出的新型二萜酸化合物。研究表明PAB可抑制胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其能夠逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的肝癌耐藥株QGY-TR50細(xì)胞

2、的化療耐藥作用，并抑制肝癌耐藥株裸鼠移植瘤的生長;同時(shí)其也能夠抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞增殖，對(duì)抗結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥性。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PAB具有逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥作用，本實(shí)驗(yàn)研究將進(jìn)一步深入探討PAB逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的分子機(jī)制，并關(guān)注其對(duì)多藥耐藥基因的影響。
　　研究方法:1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。收集處于對(duì)數(shù)生長期SGC7901及SGC7901/ADR細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度

3、的ADR，對(duì)照組加等量不含藥物的培養(yǎng)基，并設(shè)立調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)各孔吸光度值（OD值），計(jì)算ADR對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制率。2、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MRP1蛋白的表達(dá)。人胃癌多藥耐藥SGC7901/ADR細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后分為以下各組:PAB組、ADR組及PAB聯(lián)合ADR組，同時(shí)設(shè)立不加藥物處理的SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)照組，各處理因素作用24h后，4％多聚甲醛固定，以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)MRP1的表達(dá)，顯微

4、鏡下觀察染色效果，顯微鏡下(×400)攝片。3、Western blot方法檢測(cè)MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達(dá)。將SGC7901/ADR細(xì)胞分為PAB、ADR及PAB聯(lián)合ADR組，同時(shí)設(shè)立不加藥物處理的SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)照組，各處理因素作用24h后，收集細(xì)胞，提取蛋白，用Western blot方法檢測(cè)MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達(dá)水平。4、Real-Time

5、 PCR法檢測(cè)MRP1mRNA、MDR1mRNA的表達(dá)水平。以不同濃度PAB作用于人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR，同時(shí)分別設(shè)立不加藥物的SGC7901及SGC7901/ADR細(xì)胞組，收集細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)，cDNA擴(kuò)增，確認(rèn)Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，記錄CT值，采用2^-△△Ct法公式計(jì)算倍數(shù)。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS21.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩樣本均

6、數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、胃癌MDR細(xì)胞系的確認(rèn)。MTT法檢測(cè)ADR化療藥對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)ADR對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞和其親本SGC7901細(xì)胞的抑制作用有顯著差異(P＜0.05)，提示SGC7901/ADR細(xì)胞具有多藥耐藥屬性。2、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MRP1的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化

7、學(xué)檢測(cè)PAB、ADR、PAB聯(lián)合ADR對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞中MRP1的表達(dá)影響，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞中的MRP1高表達(dá)，染色呈棕黃色，PAB組中的MRP1表達(dá)略下降，ADR組中可見MRP1表達(dá)下調(diào)，PAB聯(lián)合ADR給藥組中可見MRP1的表達(dá)顯著下調(diào)，染色呈淺黃色。3、Western blot檢測(cè)MRP1、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSKβ蛋白的表達(dá)。Western blot檢測(cè) PAB、ADR及兩者聯(lián)合給藥對(duì)SGC790

8、1/ADR細(xì)胞中各種蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比MRP1、p-GSKβ、p-AKT蛋白的表達(dá)水平在PAB組、ADR組及PAB聯(lián)合ADR組中均依次下調(diào)(P＜0.05)，而AKT、GSK3β的表達(dá)水平未見明顯改變，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4、Real-Time PCR法檢測(cè)不同濃度PAB作用下耐藥細(xì)胞MRP1mRNA、MDR1mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與SGC7901細(xì)胞相比，胃癌耐藥系SGC7901/ADR細(xì)

9、胞高表達(dá)耐藥基因MDR1及MRP1(P＜0.05);且給予不同濃度PAB(5μ mol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)作用于胃癌耐藥細(xì)胞后，與未加藥物處理的SGC7901/ADR對(duì)照組相比，隨著PAB作用濃度增加，耐藥基因MDR1及MRP1的基因表達(dá)在各組中均依次下調(diào)，各處理組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PAB通過作用于MRP1分子達(dá)到逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥作用;其逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥作用可