TRAIL對胃癌細胞株SGC7901-VCR耐藥基因表達的影響及TRAIL聯(lián)合順鉑殺傷SGC7901-VCR的研究.pdf

1、胃癌的發(fā)病率仍較高，胃癌的診治仍是腫瘤診治中面臨的挑戰(zhàn)之一。早期胃癌診治效果良好，十年生存率近90％，但國內(nèi)早期胃癌的檢出率仍較低。大部分患者診斷時已經(jīng)處于中晚期而不得不接受化療?；煻嗄陙砣允俏赴┲委煹囊粋€比較重要的方法。但胃癌化療中一個令人沮喪的問題是胃癌細胞對化療藥物的耐藥問題，又稱為多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。因此，將胃癌耐藥現(xiàn)象作為研究方向，探索其可能的內(nèi)在機制和尋找對抗腫瘤細胞耐藥的干預(yù)物將

2、具有很大的價值，為篩選出抗耐藥或逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物打下基礎(chǔ)。
　　 我們在以前的應(yīng)用免疫組化的方法的研究中觀察到在人的胃癌細胞中耐藥基因如LRP、GST-π高表達且與COX-2呈正相關(guān)。同樣ELISA法在體外培養(yǎng)的胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中，也觀察到上述基因?qū)?yīng)的蛋白表達被抑制的現(xiàn)象。用COX-2抑制劑塞來昔布能下調(diào)這種表達，證實COX-2高表達與上述耐藥基因的活性的關(guān)系，顯示用外來物對耐藥基因的干預(yù)可能是有效的。腫瘤壞

3、死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducingligand，TRAIL)能誘導(dǎo)某些種類的腫瘤細胞凋亡，還對一些腫瘤細胞有細胞毒作用。近來還發(fā)現(xiàn)TRAIL和一些抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用時表現(xiàn)出協(xié)調(diào)效應(yīng)，使耐藥或部分耐藥的腫瘤細胞變得對藥物有敏感性了。TRAIL增加化療藥物殺傷腫瘤細胞的效力的機制何在？是經(jīng)典的對腫瘤細胞的促凋亡作用、與抗腫瘤藥物的協(xié)同殺傷腫瘤細胞作用還是通

4、過抑制了腫瘤細胞耐藥基因進而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性而增強了對腫瘤細胞的殺傷力。通過我們既往的研究結(jié)果，我們假設(shè)可能是后者即通過抑制腫瘤細胞耐藥基因而使腫瘤細胞的耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)。若果真如此，將對解決困擾胃惡性腫瘤化療的耐藥問題提供較好的切入點。因此，本課題分為兩個研究部分:第一部分我們采用不同濃度的TRAIL與胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR共同培養(yǎng)，觀察TRAIL對耐藥基因MDR1，LRP和GST-π有無作用效果，上調(diào)還是下調(diào)？目的是

5、對TRAIL在耐藥基因的調(diào)節(jié)中扮演的角色進行探索;第二部分我們將TRAIL聯(lián)合化療藥物順鉑加入胃癌細胞株SGC-7901/VCRTRAIL中，探討亞毒性劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)聯(lián)合小劑量化療藥物順鉑(DDP)能否協(xié)同抑制胃癌細胞株SGC-7901/VCR的活性、提高SGC-7901/VCR的凋亡率和干預(yù)其多藥耐藥基因1(MDR1)的表達，為進一步走向臨床研究打下基礎(chǔ)。
　　 第一部分:TRAILI對胃癌耐藥細

6、胞株SGC7901/VCR中MDR1，LRP和GST-π耐藥基因表達的影響
　　 目的:
　　 研究TRAIL對胃癌細胞株SGC7901/VCR多藥耐藥基因MDR1，LRP和GST-π的表達的影響，為最終在臨床上使用TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥，解決胃癌細胞多藥耐藥問題提供初步實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR與不同濃度的TRAIL(50，100，200，400 ug/L)培養(yǎng)

7、48 h，沒有任何干預(yù)措施的SGC7901/VCR細胞株作為對照，RT-PCR檢測各組胃癌耐藥細胞株耐藥基因MDR1，LRP，GST-π mRNA的表達。同時用ELISA法檢測各組胃癌耐藥細胞株中三種耐藥蛋白P-gp、LRP和GST-π的表達含量;用t檢驗及單因素方差分析的統(tǒng)計學(xué)方法進行分析，研究TRAIL對胃癌耐藥細胞株多藥耐藥基因表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR結(jié)果:
　　 對照組中胃癌耐藥

8、細胞株SGC7901/VCR中的三個耐藥基因MDR1，LRP，GST-π均呈陽性，mRNA值分別為0.88±0.01，0.91±0.04和1.01±0.13。胃癌耐藥細胞株被四種濃度的TRAIL作用，48 h后，胃癌耐藥細胞株中的MDR1，LRP，GST-πmRNA的表達被抑制，并隨著濃度的增高，抑制效益愈強，但未顯示出線性關(guān)系。TRAIL組的MDR1mRNA值在四個濃度的實驗組均較對照組顯著降低（分別為0.78±0.02;0.69±0

9、.05;0.55±0.01和0.53±0.01，與對照組相比，四組均p＜0.05）。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增，MDR1mRNA被抑制幅度有逐漸遞增的趨勢，各個濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時，對MDR1mRNA的抑制程度與200μg/L時對比，無顯著性差異(p＞0.05)。同樣，TRAIL組的LRPmRNA值在50，100，200，400μg/L四個

10、濃度的實驗組均較對照組顯著降低，其數(shù)值分別是0.85±0.05;0.76±0.05;0.59±0.04和0.58±0.02，全部四種濃度均較對照組顯著降低p＜0.05)。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增， LRPmRNA被抑制程度有逐漸遞增的趨勢，各個濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時，對LRP mRNA的抑制程度與200μg/L時對比，亦無顯著性差異(p＞0

11、.05)。與前兩者表現(xiàn)相似的是:TRAIL組的GST-πmRNA值在四個濃度的實驗組均較對照組顯著降低（分別為0.89±0.04;0.77±0.08;0.65±0.06;0.61±0.03。與對照組相比，四種濃度均顯著降低，p＜0.05）。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增，GST-πmRNA被抑制程度有逐漸遞增的趨勢，各個濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時，對

12、GST-πmRNA的抑制幅度與200μg/L時對比，無顯著性差異(p＞0.05)。
　　 2.ELISA結(jié)果:
　　 P-gp，LRP，GST-π蛋白的表達在對照組中分別是49.04±2.07 ug/L、119.35±1.04 ug/L和58.62±1.38 ug/L;與對照組相比濃度為50 ug/L的TRAIL組P-gp，LRP和GST-π的含量分別為40.42±1.89 ug/L、112.51±1.19 ug/L和5

13、7.56±1.19 ug/L（與對照組相比均p＜0.05）。濃度為100 ug/L的TRAIL組P-gp，LRP和GST-π的含量分別為36.49±0.94 ug/L、106.69±1.51 ug/L和52.30±0.80 ug/L，也均較對照組顯著降低(p＜0.05)。同時濃度為100 ug/L的TRAIL組與50 ug/L TRAIL組相比也顯著降低（均p＜0.05）。濃度為200 ug/LTRAIL組P-gp，LRP，GST-π的

14、對應(yīng)數(shù)值為25.15±0.69 ug/L、83.54±2.15 ug/L和31.41±1.65 ug/L，比對照組顯著降低(p＜0.05)。與濃度為100 ug/L TRAIL組相比也顯著降低（均p＜0.05)。濃度400 ug/L TRAIL組P-gp，LRP，GST-π的水平相應(yīng)是24.45±1.41 ug/L、82.63±1.35 ug/L、30.80±1.34 ug/L，與對照組、50 ug/L TRAIL組、100 ug/L

15、TRAIL組比較，均顯著降低(p＜0.05;)。然而濃度400 ug/L TRAIL組與200 ug/L TRAIL組比較，P-gp，LRP和GST-π的降低并無顯著性差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MDR1，LRP，GST-π在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR均有表達。
　　 2.在四種濃度的TRAIL的干預(yù)下，SGC7901/VCR中耐藥基因MDR1、LRP和GST-π的表達均較對照組顯著

16、下降且下降幅度與濃度有關(guān)。
　　 3.TRAIL除了促進腫瘤細胞的凋亡作用，它還可能通過降低腫瘤耐藥細胞株中耐藥基因MDR1，LRP，GST-π在的表達而降低胃癌的耐藥，增強化療藥物的療效。
　　 論文第二部分:TRAIL聯(lián)合順鉑殺傷胃癌細胞株SGC-7901/VCR和對耐藥基因MDR1表達的干預(yù)研究
　　 目的:
　　 探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)和小劑量化療藥物順鉑(DDP)對胃癌細胞株

17、SGC-7901/VCR的活性和聯(lián)合應(yīng)用對多藥耐藥基因1(MDR1)的影響。
　　 方法:
　　 運用MTT法檢測不同濃度的TRAIL和順鉑對胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR的活性或增殖的影響。篩選出TRAIL及順鉑的亞毒性劑量。采用流式細胞術(shù)檢測TRAIL和順鉑的亞毒性劑量下單用及聯(lián)合應(yīng)用后的細胞凋亡率。TRAIL和順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，用RT-PCR技術(shù)檢測胃癌耐藥細胞株耐藥基因MDR1 mRNA的表達。同時用ELIS

18、A法檢測耐藥蛋白P-gp的表達含量，研究TRAIL對胃癌耐藥細胞株多藥耐藥基因表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測藥物對SGC-7901/VCR細胞活力的影響的結(jié)果顯示:
　　 順鉑和TRAIL都可一定程度上殺傷胃癌耐藥細胞SGC-7901/VCR，隨著藥物濃度的增加，細胞活力下降。經(jīng)計算48 h順鉑的IC10（活性抑制10％）為0.535g/L，以MTT結(jié)果選取200μg/L作為TRAIL濃度較合

19、適。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示對照組、順鉑組、TRAIL組、TRAIL順鉑聯(lián)合用藥組中，作用48 h后胃癌細胞凋亡率以聯(lián)合用藥組細胞凋亡顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果:
　　 對照組中胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR的耐藥基因MDR1呈陽性。胃癌耐藥細胞株被TRAIL和順鉑聯(lián)合作用48小時后，胃癌耐藥細胞株中的MDR1 mRNA的表達被抑制，較對照組顯著降低(p＜0.05)。聯(lián)合用藥

20、組細胞凋亡明顯升高，與對照及單藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.ELISA法結(jié)果:
　　 與單藥組比較，聯(lián)合用藥組協(xié)同作用明顯，P-gp蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中耐藥基因MDR1高表達，MDR1是胃癌多藥耐藥的耐藥基因。
　　 2.TRAIL與順鉑聯(lián)合具有協(xié)同抑制胃癌耐藥細胞株SGC7901