腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志分子在小腸各段的表達(dá)特征及與小腸上皮增殖的關(guān)系.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的未分化細(xì)胞，不僅存在于胚胎早期，而且在成體多個組織或器官中也有定植，是維持該組織/器官正常代謝及病理狀態(tài)下修復(fù)損傷的主要細(xì)胞來源。小腸上皮組織主要由吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞及潘氏細(xì)胞四種分化成熟的細(xì)胞組成。小腸上皮不斷進(jìn)行著自我更新，使上皮細(xì)胞的衰老死亡和增殖分化處于平衡狀態(tài)，這一功能是由腸上皮干細(xì)胞(intestinal epithelial stem cell，IESC)來維持的。

2、目前認(rèn)為IESC位于小腸隱窩的基底部，距底部約4～6個細(xì)胞的位置。通過測定IESC標(biāo)志基因明確其在整個小腸的分布情況及與小腸上皮增殖的關(guān)系，有助于進(jìn)一步探討IESC的生理功能，對研究干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)和腸道腫瘤發(fā)生過程中的作用也有重要意義。 Musashi-1(Msi1)是一種進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白，在維持干細(xì)胞自我更新、分化和腫瘤發(fā)生方面起著重要作用。在哺乳動物小腸中，Msi1在距隱窩基底部4～6個細(xì)胞處的細(xì)胞中表達(dá)，與

3、公認(rèn)的IESC位置相符，提示Msi1可以作為IESC的標(biāo)志分子。Musashi—2(Msi2)也是Musashi家族中的成員，它和Msi1在神經(jīng)前體細(xì)胞共同表達(dá)，在維持細(xì)胞干性和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。但是，目前為止尚未見有關(guān)Msi2和Msi1在整個小腸中的分布特征的報道。 Hairy and enhancer of split1(Hes1)是一種基本螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，是Notch信號通路的下游分子之一。研究表明，

4、Hes1和Msi1在成體及胚胎階段的小鼠小腸中均共表達(dá)于腸隱窩底部的IESC。但是直到現(xiàn)在，對Hes1和Msi1陽性細(xì)胞的定位和表達(dá)水平的研究僅限于小腸中的某一段，Msi1、Msi2和Hes1在整個小腸中的表達(dá)特征、相互之間的關(guān)聯(lián)，以及上皮細(xì)胞增殖與各標(biāo)志基因表達(dá)的關(guān)系均未見報道。 本次研究通過在mRNA及蛋白質(zhì)水平上測定Musashi家族基因(Msi1和Msi2)和Hes1在小鼠整個小腸中各段的表達(dá)，明確各基因的表達(dá)特征，并與

5、采用BrdU和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫染色方法所獲得的小腸上皮增殖指數(shù)進(jìn)行對比，探討在整個小腸的范圍內(nèi)IESC標(biāo)志分子表達(dá)與腸上皮增殖之間的關(guān)系。 研究目的： 1.通過測定IESC的標(biāo)志分子Msi1、Msi2及Hes1在各段小腸中的表達(dá)，探討各基因在整個小腸中的表達(dá)特征； 2.探討各標(biāo)志分子的表達(dá)與小腸上皮結(jié)構(gòu)特征和增殖的關(guān)系。 研究內(nèi)容及實驗方法： 1.實驗動物及組織來源 所有實驗

6、動物來源于廣州中山大學(xué)實驗動物中心。取8周BALB/c小鼠6只(3雄3雌)。所有小鼠脫頸處死前2小時均給予BrdU腹腔注射，注射劑量為1ml/100g。完整取出整段小腸，去除頭端的5cm，剩余小腸等分為4段，分別為命名為空腸-1、空腸—2、回腸-1及回腸—2。每段小腸用0.1M PBS(pH7.4)沖洗干凈用于下一步研究。 2.組織學(xué)分析 各段小腸組織標(biāo)本取中間一段約1cm，經(jīng)4％多聚甲醛固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，連續(xù)切

7、片，分別用于HE組織形態(tài)學(xué)和免疫組化分析。在組織學(xué)分析小腸各段形態(tài)特點中，計算絨毛—隱窩高度和隱窩密度。絨毛—隱窩高度計算方法為絨毛頂端至隱窩底部的垂直距離；隱窩密度的計算方法為計算300μm單位長度小腸中的隱窩數(shù)量。 3.實時定量PCR 總RNA用TRIzol一步提取法，通過UV—2450分光光度計計算樣品260nm處紫外光吸收值來計算分離出的總RNA濃度。使用ReverTra Ace—α試劑盒將1μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄

8、為cDNA。在Rotor—Gene6000型機器上使用Realtime PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實時定量PCR。每次實驗重復(fù)兩次，取平均值以備下步分析。引物如下：小鼠Msi1，5’—TAG TTC GAG GGA CAG GCT CT—3’(上游)和5’—GTT GAG GGACAG GCA GTA GC—3’(下游)；小鼠Msi2,5’—CCG GAG TGG GGA ATT ACA TA—3’(上游)和5’—CAT A

9、GT GAG ACG GCA ATG GA—3’(下游)；小鼠Hes1，5’—GGAGAG GCT GCC AAG GTT TT—3’(上游)and5’—GCA AAT TGG CCG TCA GGA—3'(下游)；小鼠18S核醣體RNA(18SrRNA)，5’—GCT AGG AAT AAT GGA ATA GG—3’(上游)和5’—ACT TTC GTT CTT GAG GAA TG—3’(下游)。18SrRNA作為內(nèi)參，使用ΔΔC

10、t方法分析數(shù)據(jù)。 4.Western blots分析 將各段小腸標(biāo)本在4℃條件下切碎至1mm3大小以下用于Western blots分析。在各組織標(biāo)本中加入500μl RIPA裂解緩沖液。裂解液上清的總蛋白量用BCA蛋白濃度試劑盒測量。用12％的聚丙烯酰胺凝膠為分離膠，進(jìn)行垂直電泳(SDS—PAGE)，每孔蛋白樣本上樣量為40μg。電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，與稀釋于封閉液(5％奶粉，含0.1％Tween20的TBS)的一抗

11、孵育，抗體如下：兔抗小鼠Msi1抗體(1:500)，兔抗小鼠Hes1抗體(1:500)，兔抗小鼠β—actin抗體(1:1000)。二抗為辣根過氧化物共軛抗兔抗體(1:2000)。使用ECL化學(xué)熒光系統(tǒng)檢測Msi1，Hes1和β—actin蛋白。通過掃描密度計量學(xué)和Glyko BandScan5.0軟件分析確定蛋白條帶的輝度，以β—actin作為內(nèi)參分析數(shù)據(jù)。 5.免疫組織化學(xué) Msi1的免疫組化采用SAP法，4℃孵育

12、1:200稀釋的兔抗鼠Msi1多克隆抗體一抗過夜，用NBT顯色，核快紅復(fù)染；Hes1及PCNA免疫組化染色方法用SP法，用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液微波高溫抗原修復(fù)8min，3％H2O2室溫孵育10min，羊非免疫血清10min，加一抗4℃孵育過夜(兔抗鼠Hes1多克隆抗體1:200；兔抗鼠PCNA單克隆抗體1:400)，生物素化二抗37℃10min，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染。PCNA標(biāo)記的增殖指數(shù)計算方法為隱窩細(xì)胞總數(shù)中的陽性細(xì)胞

13、百分比。 BrdU染色方法與此類似，按照BrdU染色試劑盒制造商建議的步驟，生物素結(jié)合的抗BrdU抗體室溫下孵育60min，余步驟同前。BrdU標(biāo)記的增殖指數(shù)計算方法為每5個隱窩中陽性細(xì)胞百分比。以PBS代一抗作陰性對照。 6.統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)，計數(shù)資料以百分率表示，線性相關(guān)用Pearson相關(guān)系數(shù)來描述，均數(shù)的比較采用t檢驗，率的比較采用x2檢驗，線性相關(guān)用Pearso