人鼻上皮干細胞體外模型的構建及Ki67在人鼻上皮中表達及分布的研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis，CRS)與鼻息肉(Nasal polyps，NPs)的發(fā)生密切相關，大約有20％的CRS患者同時伴有鼻息肉。大多數的NPs患者的上皮出現(xiàn)結構和功能異常，包括上皮增生和鱗狀上皮化生，黏膜的慢性炎癥和異常上皮組織重塑是其主要的組織學特征。
　　由于NPs復雜的發(fā)病機制和較高的復發(fā)率，耳鼻喉科醫(yī)師對其診斷和治療面臨著極大的挑戰(zhàn)。相關研究表明，NPs的發(fā)生

2、發(fā)展過程中上皮改變起到十分重要的作用。然而，由于缺乏鼻上皮干細胞特性的關鍵信息，仍然很難區(qū)別鼻腔上皮正常和異常修復的潛在機制。有研究表明鼻腔上皮中的基底細胞具有干/祖細胞的特性并在上皮修復方面起到重要作用。因此，通過體外培養(yǎng)及比較來自正常鼻腔黏膜和鼻息肉組織的鼻上皮于細胞有助于我們從一個不同的，更特殊的方面闡明鼻腔疾病的病理生理過程。
　　多年來Ki67細胞核抗體做為評價細胞增殖能力的預測標記物已經被廣泛應用。Ki67在所有活動的

3、細胞周期都出現(xiàn)表達（G1期，S期，G2期和M期），但是在靜止期不表達（G0期）。Ki67表達的增加與腫瘤的惡性程度有關，與組織的炎癥程度相關（例如，哮喘，膽脂瘤）。既往研究顯示，鼻息肉患者重塑上皮中Ki67陽性細胞數量，與正常對照組相比出現(xiàn)明顯增加。
　　到目前為止，大多數的研究應用免疫組織化學(immunohistochemical，IHC)方法分析Ki67抗體抗人Ki67蛋白(pKi67)的陽性表達水平。但是，較少的研究關注K

4、i67蛋白的分布情況（如，結構和位置），而這些方面可能對Ki67蛋白功能的研究更有意義。按照人Ki67蛋白(pKi67)在細胞周期的不同階段，在培養(yǎng)的MCF7細胞中可以分成三種亞型:1）離散的顆粒分布在細胞核漿(早期G1);2)聚集的顆粒局限在核仁（S期到G2期）;3）聚集物分布于染色體周邊(M期）。
　　本研究的目的就是通過體內及體外實驗探討鼻息肉上皮（增生的上皮和鱗狀化生的上皮）以及正常鼻黏膜上皮中基底細胞類型以及基底細胞中K

5、i67蛋白的表達和分布類型。這些結果將同時與細胞周期相關標記物的mRNA水平進行比較。希望本研究結果能夠為鼻息肉重塑上皮潛在的分子機制提供新的見解。
　　實驗方法：
　　1、構建人上鼻上皮干/祖細胞(hNESPCs)體外模型。將來源于鼻息肉黏膜和對照組下鼻甲黏膜經過酶消化后得到的分離細胞(原代細胞，P0)種植于準備好的NIH/3T3上，以2×103細胞數/cm2的密度接種于24孔板在無血清培養(yǎng)基中生長。我們在hNESPCs細

6、胞覆蓋達80％的密度，使用酶消化的方法進行傳代。每個樣本在每一代通過計算克隆形成率和細胞倍增時間，來研究hNESPCs細胞的生長和增殖能力。hNESPCs細胞在氣-液界面(Air-liquid interface，ALI)進行分化培養(yǎng)，通過免疫細胞熒光化學染色(IF)和纖毛擺動頻率(CBF)測定進一步分析hNESPCs的分化能力并觀察分化過程。
　　2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達及分布的研究。原代細胞種植后48小時

7、或P1細胞(P2、P3)傳代72小時后，福爾馬林固定細胞用于免疫細胞化學染色，同時在這個時刻收集細胞的RNA用于進一步研究。我們采用倒置相差顯微鏡，每個樣本選擇三個視野（×400倍）觀察并計數p63+細胞、Ki67+細胞以及p63+/Ki67+雙重陽性細胞，觀察分析Ki67陽性細胞的三種亞型并拍照。采用RT-PCR方法研究Ki67蛋白及細胞周期標記物mRNA水平在hNESPCs細胞傳代過程中表達及分布情況。運用Mann-Whitney檢

8、驗方法進行統(tǒng)計學分析。
　　3.Ki67蛋白在鼻上皮細胞中表達及分布的體內實驗研究。樣本來自55例鼻息肉患者和18例正常對照組（下鼻甲）。其中15例鼻息肉患者經過3周糖皮質激素治療，并在治療前后分別取其息肉樣本。部分組織固定于福爾馬林溶液中進行IHC和IF染色用于組織學評估。另一部分組織采用RT-PCR方法進行mRNA水平檢測。分類變量的組間不同的比較采用Fisher精確檢驗。運用Mann-Whitney檢驗分析鼻息肉組和正常對照

9、組之間Ki67、p63陽性細胞數目、Ki67亞型的百分比、Ki67以及細胞周期標記物mRNA水平的表達情況。
　　實驗結果：
　　1.我們的研究證實可以從人鼻黏膜組織中分離和培養(yǎng)hNESPCs，并在至少前四代中能維持他們自我更新和分化的潛能。hNESPCs細胞可以成功的在氣液界面上(ALI)分化成分泌細胞和纖毛細胞，與呼吸道的假復層上皮非常相似。鼠纖維細胞NIH/3T3可以用作hNESPCs在無血清培養(yǎng)條件下的飼養(yǎng)層。這有助

10、于建立體外篩查和驗證人鼻腔上皮細胞活性及其對治療反應的體外模型。
　　2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達及分布的研究。在鼻息肉和下鼻甲黏膜來源hNESPCs細胞中發(fā)現(xiàn)了Ki67蛋白三種亞型。下鼻甲來源的hNESPCs在體外傳三代(P1，P2，P3)的過程中，Ⅰ型Ki67細胞占總體Ki67陽性細胞百分比分別為(18.0％，18.4％，18.6％)，Ⅱ型Ki67細胞百分比分別為(82.0％，81.6％，81.4％)。然而，

11、Ⅰ型Ki67細胞百分比在鼻息肉來源hNESPCs細胞傳代過程中逐漸從20.0％，29.58％上升到40.0％而且Ⅱ型Ki67細胞百分比在細胞傳代過程中逐漸從80.0％，70.14％下降到60.0％。此外，在P3代細胞中，Ⅰ型Ki67細胞百分比（p=0.04）與Ⅱ型Ki67細胞百分比(p=0.04)在鼻息肉來源的hNESPCs與正常鼻黏膜來源的hNESPCs之間的差異達到統(tǒng)計學意義。Ⅲ型Ki67細胞在鼻息肉和正常鼻黏膜來源的hNESPCs

12、體外傳代過程(P1-P3)中幾乎沒有觀察到。G1期相關的細胞周期標記物（CCND1、CDK4和CDK6）以及促進S期進入有絲分裂期（M期）的細胞周期相關標記物（CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1）在鼻息肉患者中表達量與對照組相比出現(xiàn)了顯著下降。M期的關鍵調節(jié)因子（CDK1、CCNA2和CCNB1）的mRNA表達水平在鼻息肉上皮的傳代過程中與正常組相比差異沒有達到統(tǒng)計學意義。
　　3.Ki67蛋白在鼻上皮細胞中表達及分布的體

13、內實驗研究。與對照組相比，p63陽性細胞數目在鼻息肉增生上皮（1.53倍，p＜0.0001）和鱗狀上皮化生上皮（2.02倍，p＜0.0001）明顯增加。增生的基底細胞有三種類型(p63+/Ki67+)并出現(xiàn)在細胞周期的不同階段，例如G1期（Ⅰ型細胞），S期到G2期（Ⅱ型細胞）以及有絲分裂期(Ⅲ型細胞)。最重要意義的是，一些Ⅰ型細胞增殖后可能會進入靜止期，雖然這些細胞仍然是p63+/Ki67+陽性細胞。Ⅰ型細胞與Ⅱ型細胞在正常鼻上皮中的比

14、值是50∶50。然而，鼻息肉增生上皮和鱗狀上皮化生上皮中，Ⅰ型細胞的百分比與對照組相比，分別上升到63.03％和64.26％，Ⅱ型細胞的百分比分別降低到34.85％和30.77％，另外Ⅲ型細胞在鼻息肉鱗狀化生的上皮中百分比是3.45％。
　　G1期相關的細胞周期標記物（CCND1、CDK4和CDK6）和促進S期進入有絲分裂期（M期）的細胞周期相關標記物（CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1）在鼻息肉患者中的表達量要遠遠低于正

15、常對照組的表達量。M期的關鍵調節(jié)因子（CDK1、CCNA2和CCNB1）在鼻息肉鱗狀化生上皮的mRNA表達水平要明顯超過鼻息肉增生上皮的表達量。IF結果顯示鼻息肉患者經過GC治療后Ki67陽性細胞數目6.0(4.0-8.0)與治療前的數目13.0(8.0-16.0)相比出現(xiàn)了明顯下降(p＜0.05)。然而，鼻息肉患者的Ⅰ型Ki67細胞百分比和Ⅱ型Ki67細胞百分比之間的不平衡在經過3周GC治療后并沒有改善。
　　實驗結論：