基因槍介導(dǎo)小麥條銹菌毒性突變的研究.pdf

1、小麥條銹病是由小麥條銹菌(Puccinia striiformis West.f.sp tritici)引起的氣流傳播性病害，是世界各主要麥區(qū)，也是我國小麥上最重要的病害和主要監(jiān)控研究對象。國內(nèi)外研究和生產(chǎn)實(shí)踐證明，種植抗銹良種是綜合控制小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、有效、易行和對環(huán)境安全的核心措施。但是小麥條銹菌毒性變異頻繁，可以通過變異產(chǎn)生新的毒性小種，導(dǎo)致小麥品種抗病基因失效，引起小麥條銹病周期性流行危害。因此，闡明小麥條銹病菌毒性變異的原因

2、和規(guī)律，是小麥抗病育種，延長小麥品種使用壽命，防治小麥條銹病亟需解決的關(guān)鍵問題。小麥條銹菌主要是通過突變和異核作用產(chǎn)生致病性變異，構(gòu)建病原菌突變體庫是對其進(jìn)行分子遺傳分析的基礎(chǔ)，也是克隆致病相關(guān)基因的捷徑。本研究探索了插入突變產(chǎn)生小麥條銹菌突變體的途徑，建立了一套有效的條銹菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，主要研究結(jié)果如下： 1.建立了小麥條銹菌基因槍法轉(zhuǎn)化體系：本研究對影響基因槍轟擊轉(zhuǎn)化率的爆裂膜承載壓力、射程、金粉用量、金粉顆粒的大小、小麥條

3、銹菌夏孢子的密度和水化時間以及轟擊時的氦氣壓等多種因子進(jìn)行了優(yōu)化。建立了優(yōu)化的小麥條銹菌基因槍法轉(zhuǎn)化體系：轟擊前將0.2mg夏孢子均勻的涂布于12cm面積的瓊脂糖培養(yǎng)基表面，置于4℃下水化2h。1μg質(zhì)粒DNA包裹500μg直徑為0.6μm的金粉顆粒為轟擊體。最適爆裂膜承載壓力為1100和1350psi，爆裂膜與承載膜之間的距離為2.5cm，承載膜與阻擋網(wǎng)之間的距離為0.8cm，阻擋網(wǎng)與靶細(xì)胞之間的距離為6cm，氦氣壓為2.7×10<'

4、4>Pa。 2.明確基因槍法轉(zhuǎn)化條銹菌后報告基因的瞬時表達(dá)特點(diǎn)，確認(rèn)GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作為條銹菌轉(zhuǎn)化體的篩選標(biāo)記：以攜帶GUS基因的質(zhì)粒(pGUS6L20)轉(zhuǎn)化小麥條銹菌，GUS基因在經(jīng)爆裂膜承載壓力為900、1100、1350、1550psi時所轉(zhuǎn)化的小麥條銹菌夏孢子中均有表達(dá)，隨爆裂膜承載壓力增大GUS基因瞬時表達(dá)率逐漸升高。經(jīng)爆裂膜承載壓力為1350和1550psi處理后，GUS基因在夏孢子中的表達(dá)率相對

5、較高可達(dá)到0.2％和0.34％，但是轉(zhuǎn)化后的夏孢子萌發(fā)率卻只有25％左右。同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)：X-Gluc染色后，有些孢子顏色呈深藍(lán)色，有些孢子則呈淺藍(lán)色，表明在銹菌孢子中GUS基因的拷貝數(shù)和表達(dá)量有差別。以攜帶潮霉素抗性基因hpt的質(zhì)粒(pKLHygl4)轉(zhuǎn)化條銹菌夏孢子，在爆裂膜承載壓力為650、900、1100psi時，轉(zhuǎn)化后的條銹菌夏孢子在含有50gμg/mL潮霉素B的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率都比對照有顯著的提高，說明hpt基因已在夏孢子中表

6、達(dá)。因此GUS基因和潮霉素抗性基因hpt均可作為條銹菌轉(zhuǎn)化體的篩選標(biāo)記。 3.獲得了基因槍法轉(zhuǎn)化的條銹菌毒性突變體：以小麥條銹菌白化單孢菌系-5為轉(zhuǎn)化受體，以分別含有GUS基因和潮霉素抗性基因(hpt)的質(zhì)粒為載體，采用基因槍法轉(zhuǎn)化小麥條銹菌。以攜帶GUS基因的質(zhì)粒pGUS6L20轉(zhuǎn)化小麥條銹菌，經(jīng)爆裂膜承載壓力為1350和1550psi處理后，在其后代中檢測到GUS基因表達(dá)，隨著代數(shù)的增加表達(dá)量減少，三代后檢測不出來。以攜帶潮

7、霉素抗性基因hpt的質(zhì)粒pKL,Hyg14轉(zhuǎn)化小麥條銹菌后，經(jīng)爆裂膜承載壓力為1100psi處理后，得到兩個穩(wěn)定的毒性突變菌株M<,1100-4-2>、M<,11OO-4-3>。M<,1100-4-2>菌株對南大2419的毒性減弱，反應(yīng)型由野生菌系的4型變?yōu)?型；M<,1100-4-3>菌株在南大2419的反應(yīng)型由野生菌系的4型變?yōu)?、3型，毒性發(fā)生分化。采用中國鑒別寄主對突變體的毒性研究表明，各突變菌株的毒性均較原始菌系發(fā)生了明顯改變