基因槍介導(dǎo)的DSP為載體的基因轉(zhuǎn)染初步研究.pdf

1、背景:隨著近代生物技術(shù)的發(fā)展與人類基因庫的不斷完善,人們在理論上和實(shí)踐上的不斷探索,基因治療對許多疾病提供了一個(gè)新的治療途徑。所謂基因治療是指在基因水平上將有功能的基因或其他基因通過基因轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入患者體內(nèi),并使之表達(dá)正常的基因,或表達(dá)患者原來不存在或表達(dá)很低的外源基因。基因治療的基本條件包括:目的基因的獲取,靶細(xì)胞的選擇,將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法和途徑。目前基因載體的主要分為兩類:病毒載體或非病毒載體。非病毒載體具有的安全性,低免疫

2、原性等優(yōu)勢成為研究的重點(diǎn)。其中如何將目的基因有效的轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞或者靶部位是十分關(guān)鍵的步驟,基因槍作為純物理方式的非病毒轉(zhuǎn)染方法能夠方便、有效的轉(zhuǎn)運(yùn)基因,已經(jīng)越來越受到研究者的關(guān)注。
　　 目的:合成葡聚糖.精胺陽離子聚合物DSP,擴(kuò)增和提取質(zhì)粒DNApmcherry-c1和pEGFP-c3,研究以DSP為粘合劑制備基因槍子彈的方法,初步探討在同等條件下,用基因槍方法和普通轉(zhuǎn)染方法在體外的轉(zhuǎn)染能力比較,和用DSP作為粘合劑和用傳統(tǒng)

3、亞精胺作為粘合劑進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染能力的比較,以及用基因槍方法共轉(zhuǎn)染同單獨(dú)轉(zhuǎn)染能否發(fā)揮協(xié)同作用,提高轉(zhuǎn)染率的研究。
　　 方法:研究首先以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應(yīng)起始物,在室溫下經(jīng)高碘酸鉀氧化6個(gè)小時(shí),得到了氧化葡聚糖。通過鹽酸羥胺法測定了氧化葡聚糖醛基的含量,根據(jù)此含量按照1:1.25摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應(yīng),該反應(yīng)能生成含希夫氏堿的葡聚糖.精胺亞胺聚合物,所得到的聚合物在過量硼氫化鈉作用下,可還原生成穩(wěn)定葡聚糖一

4、精胺共價(jià)陽離子聚合物(DSP)。DSP通過FT-IR及1 H-NMR其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,并用三硝基笨磺酸法(TNBS)測定其醛基的含量。
　　 采用堿裂解法分別擴(kuò)增和提取了具有紅色熒光蛋白的質(zhì)粒pmcherry-c1和具有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP-c3。首先將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中,增殖轉(zhuǎn)化的大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒DNA,然后采用堿裂解法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA并采用質(zhì)粒提取試劑盒除去其中的菌體殘片及內(nèi)毒素等進(jìn)行了純化。通過紫外

5、分光光度計(jì)測量其濃度和純度,并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了鑒定。
　　 制備了基因槍子彈,以DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺做為粘合劑制備基因槍子彈,以pmcherry-c1為報(bào)告基因,轟擊乳腺癌細(xì)胞(MCF-7),考察了基因槍轉(zhuǎn)染技術(shù)對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞的生存率的影響,并采用了星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化了試驗(yàn)的條件,通過熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染率；MTT法考察復(fù)合物細(xì)胞毒性,在同等條件下以亞精胺法制備了基因槍子彈作為對照。在此基

6、礎(chǔ)上,研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實(shí)現(xiàn)了兩種質(zhì)粒pmcherry-c1和PEGFP-c3的共轉(zhuǎn)染,以亞精胺法制備了基因槍共轉(zhuǎn)染子彈作為對照。
　　 結(jié)果:所合成氧化葡聚糖醛基含量為7.27 mmol/g,DSP中接枝精胺的濃度為0.0214mg/ml。所提取的質(zhì)粒DNA的純度(比值在1.8-2.0之間)pmcherry-c1A260/A280=1.94,pEGFP-c3 A260/A280=1.92,其濃度分別Cpmc

7、herry-c1=492.8ug/ml,CpEGFP-c3=498.1ug/ml.用DSP為載體,用化學(xué)方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmcherry-c1,得到轉(zhuǎn)染率為14.8％,細(xì)胞生存率為83.2％。用所合成的DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺作為粘合劑,以質(zhì)粒pmcherry-c1作為報(bào)告基因,制備了基因槍子彈,用星點(diǎn)設(shè)計(jì).效應(yīng)面法,優(yōu)化了用基因槍法轉(zhuǎn)染體外MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件。其優(yōu)化條件為:每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質(zhì)粒DNA的量為1.2ug,基因

8、槍的壓力為1.5kpa,轟擊距離2cm。得到的轉(zhuǎn)染效率為22.1％,細(xì)胞生存率為52.2％,同通過模型預(yù)測值的偏差的絕對值為8.3％,6.1％。同時(shí)在同等條件下,用傳統(tǒng)的亞精胺法制備了基因槍子彈作為對照,轟擊細(xì)胞后得到其轉(zhuǎn)染率為15.8％,細(xì)胞生存率為54.5％。研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實(shí)現(xiàn)了2種質(zhì)粒pmcherry-cl和pEGFP-c3的共轉(zhuǎn)染,在每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質(zhì)粒DNA的量為1.2ug,基因槍的壓力

9、為1.5kpa,轟擊距離2cm條件下,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmeherry-cl得到轉(zhuǎn)染率為21.0％,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-c3得到轉(zhuǎn)染率為19.9％,共同轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒DNA得到轉(zhuǎn)染率為23.0％,同時(shí),以同樣方法下以亞精胺法制備了基因槍,在同等條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmcherry-cl得到轉(zhuǎn)染率為15.5％,單獨(dú)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-c3得到轉(zhuǎn)染率為15.2％,共同轉(zhuǎn)染這兩種質(zhì)粒DNA得到轉(zhuǎn)染率為17.9％。