基因槍介導(dǎo)的小麥抗赤霉病相關(guān)RNAi片段的轉(zhuǎn)化及其后代鑒定.pdf

1、小麥?zhǔn)侵饕Z食作物，赤霉病是小麥的重要病害，不僅大幅降低小麥產(chǎn)量，還嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)。由于小麥抗赤霉病種質(zhì)資源匱乏，植物中沒有免疫或高抗赤霉病的材料，所以通過常規(guī)育種方法培育抗赤霉病小麥新品種的難度較大。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將非植物源的抗病基因?qū)胄←?，篩選、鑒定整合這類抗病基因的小麥材料，將為培育抗赤霉病小麥新品種提供新種質(zhì)。
　　本研究通過基因槍介導(dǎo)法，以Pmi/甘露糖為篩選體系，將RNAi基因赤霉菌麥角固醇合成Cyp51基

2、因、幾丁質(zhì)合酶(Chitin synthase，Chs)Chs3b基因、葡聚糖合酶(Glucan synthase，Gls)Gls基因、細(xì)胞分裂Myo基因以及與毒素合成相關(guān)的8mR7和8mR12-47基因，組成不同組合，共轉(zhuǎn)化不同小麥品種，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小麥材料8份;還繁殖和鑒定實(shí)驗(yàn)室前期研究中篩選的部分轉(zhuǎn)基因小麥株系8份。主要結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)基因小麥的篩選與鑒定
　　①將Cyp51BAC和Gls基因RNAi片段及

3、篩選標(biāo)記基因Pmi，共轉(zhuǎn)化小麥品種襄麥76，篩選獲得1株T0代植株，編號(hào)為XⅡ。T1～T4代的鑒定表明，XⅡ株系同時(shí)含有cyp51BAC、gls2-gls6和Pmi基因，現(xiàn)已經(jīng)純合。
　?、趯NAi片段Gls2-t-Gls6、chs3b-t-AS2-AS3和Pmi基因共轉(zhuǎn)化襄麥76，篩選獲得24株T0代植株，其中6株含有三個(gè)基因，13株含Gls2-t-Gls6和Pmi基因，5株僅含Gls2-t-Gls6基因。T1～T3代的鑒定表

4、明，12個(gè)T0代株系的后代分離較大，至T3代時(shí)仍在分離。其余12個(gè)T0代株系在T1代未檢測(cè)到外源基因。
　?、蹖NAi片段chs3b-AS5-t-AS5、chs3b-AS3-t-AS3和Pmi共轉(zhuǎn)化鄭麥9023和襄麥76，篩選獲得11株T0代植株，其中2株來自鄭麥9023為受體的遺傳轉(zhuǎn)化，含有Pmi和chs3b-AS3-t-AS3基因，T2代仍有分離。其余9株是來自襄麥76為受體的轉(zhuǎn)基因材料，其中5株含有Pmi和chs3b-AS

5、3-t-AS3基因，在T1～T3代仍在分離;4株僅含標(biāo)記基因。
　?、軐⒑煌瑔?dòng)子RNAi片段Myo2-AS6、Pmi標(biāo)記基因共轉(zhuǎn)化襄麥76，篩選獲得5株T0代植株，其中4株的T3代仍有嚴(yán)重分離，1株在T3代已經(jīng)純合。
　　⑤將不同啟動(dòng)子的RNAi片段8mR7、標(biāo)記基因Pmi共轉(zhuǎn)化襄麥76和鄭麥9023，篩選獲得16株T0代植株，其中15株來自襄麥76為受體的遺傳轉(zhuǎn)化，1株來自鄭麥9023為受體，它們的T2代仍在分離。

6、r>　?、迣⒉煌瑔?dòng)子的RNAi片段8mR12-47和標(biāo)記基因Pmi共轉(zhuǎn)化襄麥76，篩選獲得3株T0代植株，T2代已趨于純合。
　?、邔⒉煌瑔?dòng)子的RNAi片段chs3b-5*2Pmi共轉(zhuǎn)化襄麥76，篩選獲得1株T0代植株，自交后代均含有chs3b-5*2和Pmi基因，T2代已經(jīng)純合。
　　⑧將cyp51基因的RNAi片段及D4E、Opt1和AFP三個(gè)抗菌肽基因及Pmi共轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158，篩選獲得4株T0代植株，所有T1代植株

7、均為陽性，含有部分或全部外源基因，這些材料已經(jīng)純合。
　　2.實(shí)驗(yàn)室前期獲得的部分轉(zhuǎn)基因小麥材料的繁殖及鑒定
　?、俸琧hs3bAS2-AS3、chs3bAS5-AS1RNAi片段轉(zhuǎn)基因（受體:襄麥76）株系JB、JV、M、J、Z，這5個(gè)株系仍未純合。
　　②含不同啟動(dòng)子的chs3b5*2轉(zhuǎn)基因株系（受體:襄麥76）3B，T1代僅獲得2株同時(shí)含chs3b-5*2和Pmi基因的陽性植株，以及2株僅含Pmi的植株。