微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)阻斷正常脾臟血流的研究.pdf

1、背景：
　　 脾臟是人體內(nèi)最大的免疫器官,擁有多種免疫活性細(xì)胞因子,有著重要的抗感染、抗腫瘤功能，同時(shí)又是機(jī)體儲(chǔ)血、濾血、造血和毀血的器官；研究還發(fā)現(xiàn)脾臟與機(jī)體內(nèi)分泌關(guān)系密切；對(duì)肝臟、腸道的多種生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。傳統(tǒng)治療脾亢的方法有脾切除、脾動(dòng)脈部分栓塞術(shù)（PSE）和脾臟射頻消融術(shù)（RFA）。脾切除不僅容易導(dǎo)致免疫力下降，增加感染的發(fā)生幾率，而且還可能增加血漿的粘滯度，提高血栓栓塞的發(fā)生率；脾動(dòng)脈部分栓塞術(shù)和脾臟射頻消

2、融有誘發(fā)出血的危險(xiǎn)，而且伴有劇烈疼痛、發(fā)熱等反應(yīng)。
　　 超聲空化效應(yīng)是超聲熱效應(yīng)之外的另一種主要的物理效應(yīng)；是指液體中微氣泡在超聲作用下產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及內(nèi)爆等一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程，伴隨瞬態(tài)高溫、高壓、沖擊波、放電和微射流等多種能量釋放行為。微泡可以降低超聲空化的閾值，用低能量的超聲激發(fā)情況下，可以發(fā)生顯著的空化效應(yīng)，后者可以造成小血管管壁機(jī)械損傷、出血、血腫和血栓形成。
　　 研究目的：
　　 已知微泡增強(qiáng)

3、的超聲空化可能產(chǎn)生顯著的血管損傷效應(yīng)。本研究采用自行研發(fā)的新型脈沖式超聲治療儀，聯(lián)合靜脈注射超聲造影劑，對(duì)健康新西蘭大白兔的脾臟進(jìn)行血流阻斷的治療，視覺(jué)比較治療前后靶區(qū)脾臟的灰度超聲造影，定量分析實(shí)驗(yàn)前后脾實(shí)質(zhì)的造影聲學(xué)強(qiáng)度，了解其血供情況和血循環(huán)的狀態(tài)；同時(shí)，病理切片檢查探討脾臟血流阻斷初步的病理機(jī)制，對(duì)脾臟超聲空化的生物學(xué)效應(yīng)和潛在的治療作用進(jìn)行初步的研究。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組健康成年新西蘭

4、大白兔36只，雌雄不限，體質(zhì)量1.7-2.5kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。根據(jù)是否進(jìn)行超聲照射、有無(wú)微泡介導(dǎo)、有無(wú)凝血酶原參與將36只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成四組，A：?jiǎn)渭兾⑴萁M(Microbubbles，MB)；B：?jiǎn)渭兂暯M(Ultrasound，US)；C：超聲微泡組（Ultrasound and Microbubbles，USMB）；D:凝血酶原+超聲微泡組（Prothrombin and Uultrasound and Micro

5、bubbles，PUSMB）；每組9只。PUSMB組予緩慢靜脈推注凝血酶原（20IU/kg）后立即采用脈沖式超聲照射聯(lián)合經(jīng)靜脈微泡注射；USMB組采用脈沖式超聲照射聯(lián)合經(jīng)靜脈微泡注射；US組用等量的生理鹽水替代微泡，采用脈沖式超聲照射；MB組經(jīng)靜脈推注微泡，超聲治療頭假照。
　　 二、實(shí)驗(yàn)儀器與材料脈沖式聚焦超聲治療儀，由第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科提供，超聲頻率831KHZ，脈沖寬度100-1000微秒可調(diào)，峰值聲壓4.6M

6、pa，平均聲強(qiáng)0.89W/cm2?！爸@”脂膜微泡，第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科研制，其核心氣體為全氟丙烷，外觀呈乳白色凝乳狀，平均粒徑2μm，其中98％小于8μm，微泡濃度為4－9×109/ml。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 經(jīng)耳緣靜脈注射2％的戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，劑量1.5ml/kg，同時(shí)建立耳緣靜脈通道。麻醉后將兔仰臥固定于實(shí)驗(yàn)裝置解剖臺(tái)上，經(jīng)手術(shù)暴露脾臟后輕輕牽出腹腔，以生理鹽水紗布周?chē)潭?。PUSMB組予靜脈

7、緩慢推注20IU/kg凝血酶原后，立即經(jīng)靜脈緩慢推注微泡，劑量為0.1ml/kg的生理鹽水稀釋液，同時(shí)用超聲治療頭垂直脾臟輕接觸輻照5min；USMB組無(wú)凝血酶原注射，其余與PUSMB組相同；US組以超聲治療探頭垂直輻照5min，用相同劑量的生理鹽水替代微泡；MB組經(jīng)靜脈注射微泡同USMB組，同時(shí)超聲治療頭假照脾臟5min。治療前及治療后0min、30min和60min四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)脾臟進(jìn)行診斷性的超聲造影檢查并記錄二次諧波灰度超聲造影動(dòng)

8、態(tài)影像。造影完成后，回放動(dòng)態(tài)圖像，啟用聲學(xué)密度的分析軟件QLAB，分析脾臟實(shí)質(zhì)感興趣區(qū)域（ROI）輻照前及輻照后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)間強(qiáng)度曲線（TIC），計(jì)算達(dá)峰時(shí)間（t）及峰值強(qiáng)度（PI）。每組治療后0min時(shí)隨機(jī)選取其中的三只實(shí)驗(yàn)兔處死，治療后60min后處死其余的實(shí)驗(yàn)兔，均獲取脾臟輻照區(qū)及其周?chē)M織，進(jìn)行常規(guī)病理切片，HE染色，光鏡下檢查組織的病理學(xué)改變。
　　 四、超聲造影分析
　　 使用PILLIPS公司IU22彩色多

9、普勒超聲診斷儀，9L高頻線陣探頭，頻率5-9MHz，超聲造影模式。造影時(shí)先使用二維顯像方式顯示脾臟縱切面，調(diào)整好放大的倍數(shù)、圖像深度；然后選擇最佳顯示切面,切換到造影狀態(tài)，打開(kāi)雙幅模式，顯示屏上出現(xiàn)雙幅實(shí)時(shí)圖像，一幅為用來(lái)觀察造影的圖像，另一幅為實(shí)時(shí)的灰階圖像，用來(lái)監(jiān)視從而保證始終處在同一切面圖上；抽取“脂氟顯”微泡懸液（0.02ml/kg），用生理鹽水稀釋成5ml后經(jīng)耳緣靜脈快速推注完畢（3－5s內(nèi)），隨即用2ml生理鹽水沖注；注入造

10、影劑同時(shí)啟動(dòng)超聲診斷儀內(nèi)置記時(shí)器實(shí)時(shí)不間斷的觀察脾臟切面的灌注及回聲強(qiáng)度，記錄各組在脈沖聚焦超聲治療前及治療后0min、30min和60min靶區(qū)的二次諧波灰度超聲造影動(dòng)態(tài)影像；啟用QLAB聲學(xué)密度分析軟件，選擇正方形的取樣框，大小約1.5×1.5mm，置于脾臟輻照區(qū)域（脾臟暴露部分的中央?yún)^(qū)域，ROI邊緣位于上下包膜的中央），避開(kāi)顯影的大血管，由儀器自帶程序自動(dòng)繪制成-強(qiáng)度曲線（TIC）,計(jì)算出達(dá)峰時(shí)間（t）及峰值強(qiáng)度（PI）。

11、　　 五、病理檢查
　　 輻照后大體觀察脾臟外觀、輻照區(qū)域的損傷情況；取材輻照區(qū)域及周邊未損傷組織，于福爾馬林液固定，HE染色，光鏡觀察組織的病理學(xué)改變，包括血栓、微血栓、血管周?chē)敖M織細(xì)胞的改變。
　　 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 各組數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，同組治療前后的數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)檢驗(yàn)，不同組之間比較采用成組均數(shù)比較的檢驗(yàn)或檢驗(yàn)，檢驗(yàn)均以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行。

12、　　 結(jié)果：
　　 36只實(shí)驗(yàn)兔全部完成實(shí)驗(yàn)過(guò)程。
　　 一、大體病理觀察
　　 治療前各組脾臟呈均勻的鮮紅色。治療后，凝血酶原聯(lián)合超聲微泡治療組、超聲微泡治療組脾臟的輻照區(qū)域呈明顯暗紅色，未輻照區(qū)略變暗，輻照區(qū)與未輻照區(qū)有較清晰的邊界；單純超聲組和單純微泡組脾臟整體略變暗，輻照區(qū)域（假照區(qū)）與正常組織之間無(wú)明顯分界。
　　 二、超聲造影結(jié)果
　　 （一）肉眼觀察：治療前可見(jiàn)造影劑迅速進(jìn)入脾臟組

13、織，脾臟整體呈均勻一致的增強(qiáng)，血流灌注良好，無(wú)充盈缺損，視覺(jué)分析無(wú)顯著差異。治療后0min，PUSMB組、USMB組可見(jiàn)造影劑緩慢地由脾動(dòng)脈進(jìn)入輻照區(qū)域，該區(qū)域增強(qiáng)延遲，增強(qiáng)程度降低，呈明顯的低灌注區(qū)和負(fù)性顯影區(qū)，與周邊正常脾臟組織分界較清晰，結(jié)果重復(fù)性好；MB組和US組造影劑仍然迅速地進(jìn)入輻照區(qū)域，呈均勻增強(qiáng)，灌注良好，與治療前無(wú)差別。治療后30min、60min，PUSMB組輻照區(qū)域增強(qiáng)仍延遲，灌注增強(qiáng)繼續(xù)減低，缺損區(qū)增大；USMB

14、組輻照區(qū)域灌注缺損縮小，灌注的強(qiáng)度有所恢復(fù)；MB組和US組則無(wú)明顯變化。
　　 （二）聲學(xué)密度（AD）定量分析：治療前，各組TIC曲線上升支陡直，治療后PUSMB組、USMB組的TIC曲線上升支平緩，峰值強(qiáng)度（PI）值分別由治療前的22.2±0.48、21.7±0.50降至治療后0min的13.8±1.92、12.4±1.89。達(dá)峰時(shí)間（t）值分別由治療前的8.2±0.54、7.9±0.64延長(zhǎng)為治療后0min的15.6±1.3

15、7、10.8±1.56。治療后30min，60min觀察，PUSMB組、USMB組的達(dá)峰時(shí)間與0min相近，PUSMB組PI值不斷下降，USMB組PI值出現(xiàn)不同程度的上升。US組、MB組治療前后各時(shí)間點(diǎn)TIC曲線未見(jiàn)明顯改變，達(dá)峰時(shí)間及峰值強(qiáng)度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 三、病理學(xué)檢查MB組：治療后0min及治療后60min均可見(jiàn)脾竇大小均勻，內(nèi)見(jiàn)幾個(gè)紅細(xì)胞；脾索結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)明顯出血、細(xì)胞變性、水腫和血栓形成。
　　 US

16、組：治療后0min及治療后60min均可見(jiàn)脾竇稍擴(kuò)張，但大小尚均勻，脾索結(jié)構(gòu)清楚，可見(jiàn)幾個(gè)紅細(xì)胞滲出，未見(jiàn)出血、細(xì)胞變性、水腫和血栓形成。
　　 USMB組：治療后0min，可見(jiàn)脾竇不同程度地?cái)U(kuò)張，內(nèi)見(jiàn)較多紅細(xì)胞滲出；脾索受壓結(jié)構(gòu)不清楚，血管周?chē)M織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的水腫，小血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成；治療后60min，可見(jiàn)脾竇擴(kuò)張程度稍減輕，仍有較多紅細(xì)胞滲出，部分小血管內(nèi)仍可見(jiàn)血栓形成；脾索受壓情況稍緩解，結(jié)構(gòu)隱約可見(jiàn)，血管周?chē)M織

17、細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的水腫。
　　 PUSMB組：治療后0min，脾竇顯著擴(kuò)張、內(nèi)見(jiàn)大量紅細(xì)胞淤積，脾索受壓，結(jié)構(gòu)不明顯，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可見(jiàn)小血管內(nèi)血栓形成；治療后60min，脾竇仍然顯著擴(kuò)張，除部分血竇內(nèi)可見(jiàn)微血栓形成外，稍大血管內(nèi)也可見(jiàn)血栓形成；血管周?chē)M織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的水腫。
　　 結(jié)論：
　　 一、微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)可阻斷正常兔脾臟組織的血流，表現(xiàn)為灌注明顯延遲、減少及出現(xiàn)缺損區(qū)，但隨著時(shí)間的推移