微泡超聲空化的肝創(chuàng)傷止血作用及其病理機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性肝損傷是腹外傷中最嚴(yán)重、死亡率最高的臟器損傷之一。在腹部外傷中,創(chuàng)傷性肝損傷的發(fā)生率僅次于脾損傷,而死亡率卻占首位,高達(dá)10％-15%,其中,外傷所致不可控制的出血是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。我們知道,肝臟具有物質(zhì)代謝、合成蛋白質(zhì)、解毒、內(nèi)分泌等許多重要的生理功能,肝功能的異常必然會(huì)影響到機(jī)體的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸,因此,盡早止住活動(dòng)性出血、盡量實(shí)施保留臟器的治療、為再次手術(shù)贏得時(shí)間是創(chuàng)傷早期救治中的重要環(huán)節(jié)。
　

2、　目前,創(chuàng)傷性肝損傷的治療方法主要有剖腹手術(shù)治療和腹腔鏡、選擇性動(dòng)脈栓塞、ERCP和CT引導(dǎo)等微創(chuàng)治療。肝臟是人體最大的實(shí)體器官,其血運(yùn)豐富,質(zhì)地柔軟、易脆,抗?fàn)坷瓘?qiáng)度低,手術(shù)縫合修補(bǔ)比較困難。手術(shù)止血治療過程中應(yīng)用較為廣泛的止血方法是填料止血,直接作用于創(chuàng)面達(dá)到壓迫止血的目的,該方法的缺點(diǎn)是需要二次手術(shù)取出紗布,并且并發(fā)癥較高;另一種方法是采用明膠海綿等止血材料填塞,此方法耗時(shí)較長且對操作者熟練程度要求高;而微創(chuàng)技術(shù)大多要求有大型儀器

3、設(shè)備,操作比較復(fù)雜。微創(chuàng)肝創(chuàng)傷止血技術(shù)是近年發(fā)展方向,主要有:介入血管栓塞、微波或者射頻熱凝固止血、高強(qiáng)度聚焦超聲熱凝固止血以及超聲引導(dǎo)下注射止血?jiǎng)┑?。因?盡管這些治療方法有各自的優(yōu)勢,但在實(shí)際應(yīng)用不能滿足及時(shí)診斷、快速止血的要求,存在相應(yīng)的不足。
　　微泡超聲空化是一已知的物理現(xiàn)象,體內(nèi)超聲空化的發(fā)生依賴微泡的形成、生長和壓縮崩潰內(nèi)爆。超聲造影劑微泡是一種有效的空化核,其增強(qiáng)超聲空化血管損傷的生物學(xué)效應(yīng)已在血管、心肌等多方面的

4、研究中被證實(shí)。肝臟血流豐富、肝內(nèi)血竇血流緩慢、微泡有肝內(nèi)聚集特征,更有利于發(fā)揮微泡超聲空化對肝內(nèi)血管的機(jī)械損傷作用。前期研究發(fā)現(xiàn),微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)通過損傷輻照靶區(qū)的肝實(shí)質(zhì)微小血管,可對毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞甚至小靜脈造成嚴(yán)重的機(jī)械損壞,造成廣泛的微小血腫和水腫;還可導(dǎo)致肝細(xì)胞氣球樣變性、渾濁腫脹,壓迫肝內(nèi)血竇,致肝內(nèi)血管回流受阻,血管閉塞,具有暫時(shí)性阻斷局部正常肝臟血液循環(huán)的作用。
　　目的:
　　在前期微泡增強(qiáng)的超聲空化效

5、應(yīng)阻斷局部正常肝血流的基礎(chǔ)上,通過建立兔肝臟切割傷模型,探討脈沖式治療超聲聯(lián)合靜脈注射微泡,是否能快速有效治療肝創(chuàng)傷后出血,及其止血作用的病理機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.主要實(shí)驗(yàn)材料
　　1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康新西蘭白兔20只,雌雄不限,體重1.8–2.5kg,由新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　1.2超聲化治療儀:CZ-960型,治療頭頻率831kHz,峰值聲壓為4.8MPa,采取工作8s間歇8s的交替治療模

6、式,平均聲強(qiáng)(ISPTA)為1.39W/cm2。
　　1.3超聲診斷儀:使用GE公司Logiq9型彩色多普勒超聲診斷儀,探頭為9L高頻線陣探頭,頻率5~9MHz,具有編碼諧波超聲造影模式。
　　1.4脂質(zhì)微泡:使用本科室實(shí)驗(yàn)室研制的脂氟顯脂質(zhì)造影劑,主要核心氣體為全氟丙烷,乳白色液體,粒徑范圍2~10μm,其中98%在8μm以下,濃度為(4~9)×109/ml。超聲造影時(shí)劑量為0.02ml/kg,用于超聲治療時(shí)劑量為0.1m

7、l/kg(微泡溶入5ml生理鹽水中制成微泡混懸液)。
　　1.5麻醉試劑:2%戊巴比妥鈉和陸眠寧II注射液。電子天平稱取2.0g戊巴比妥鈉粉劑,以100ml超純水溶解后,磁力攪拌器攪拌均勻,并用0.22μm濾器過濾除菌,分裝于100ml無菌瓶中備用。陸眠寧II注射液主要成分為乙二胺四乙酸、二甲苯胺噻唑、鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所研制。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　2.1肝切割傷動(dòng)物模型的建

8、立:健康新西蘭大白兔20只,雌雄不限,體質(zhì)量1.8–2.5kg。麻醉后開腹暴露肝臟,用手術(shù)刀片在兔肝左葉(避開右葉膽囊區(qū))制備一個(gè)長20mm、深5mm的切口。
　　2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理:將建模后的新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組,即超聲聯(lián)合微泡組(MEUS組)8只、單純超聲組(US組)6只和假照組(Sham組)6只。MEUS組采用4.8MPa的脈沖式治療超聲聯(lián)合經(jīng)靜脈注射微泡(0.1ml/kg)治療肝切割傷后出血;US組使用超聲輻照和同等

9、劑量的生理鹽水替代微泡;Sham組經(jīng)靜脈注射同等劑量生理鹽水,同時(shí)僅予以超聲探頭假照,不發(fā)射能量。
　　2.3實(shí)驗(yàn)步驟:實(shí)驗(yàn)兔采用復(fù)合式麻醉,先肌注陸眠寧II(0.1ml/kg),再建立耳緣靜脈通道,注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/kg)。麻醉后采用劍下正中線切口,暴露肝臟后,輕輕將兔肝左葉拖出腹腔用于實(shí)驗(yàn)。各組先用二維超聲和多普勒超聲觀察肝葉形態(tài)、血流情況等,MEUS組和Sham組建模前先經(jīng)耳緣靜脈造影團(tuán)注“脂氟顯”微泡(0.0

10、1ml/kg)對肝臟進(jìn)行超聲造影觀察,并記錄峰值聲學(xué)密度值(PI)。建立肝切割傷模型后,用濾紙收集各組初始出血速率(初始出血速率=10s出血量/10s),然后各組處理方式如下:MEUS組在經(jīng)靜脈緩慢推注微泡(0.1ml/kg,以生理鹽水稀釋至3ml)的同時(shí)用超聲治療探頭輻照切口區(qū)2min;US組用3ml生理鹽水代替微泡,同時(shí)用治療頭輻照2min;Sham組用3ml生理鹽水替代微泡,同時(shí)治療頭假照2min。三組治療完后觀察即刻止血效果并視

11、覺評分,收集10min出血總量。最后各組均超聲造影觀察肝血流阻斷情況。三組各取3只兔于實(shí)驗(yàn)完成后即刻取輻照區(qū)組織標(biāo)本做病理切片用于止血病理機(jī)制研究,其余實(shí)驗(yàn)兔留觀48h后觀察肝臟壞死情況,并切取組織標(biāo)本肉眼判定大體壞死程度,送病理檢查。
　　2.4止血效果評估及數(shù)據(jù)分析:用各組治療前后超聲造影PI值分析肝臟血流灌注的改變;用肝葉切割后的初始出血速率、10min出血量及出血視覺評分作為止血效果觀察指標(biāo)。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)

12、計(jì)。初始出血速率,10min出血量,視覺評分和超聲造影PI值均用?x±d表示。初始出血速率,10min出血量和出血視覺評分采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),如果總的差異有顯著性,則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。MEUS組和Sham組前和治療后的峰值強(qiáng)度值進(jìn)行配對t檢驗(yàn)比較。均以P<0.01被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　3.1肝切割傷建模結(jié)果:20只新西蘭大白兔均成功建立肝葉切割傷模型,傷口長20m

13、m,深5mm,實(shí)驗(yàn)過程中無一例死亡。
　　3.2超聲造影血流灌注分析:記錄各實(shí)驗(yàn)組在治療前、治療后即刻和治療后48h的動(dòng)態(tài)灰階造影影像,存儲(chǔ)于硬盤中用于后續(xù)分析。使用超聲診斷儀自帶的造影分析軟件,選取超聲輻照區(qū)域的肝組織部分為感興趣區(qū)(RegionofInterest,ROI),取樣時(shí)注意避開大中血管斷面,取樣框大小約3mm×4mm,得到兔肝葉的時(shí)間-強(qiáng)度曲線(timeintensitycurve,TIC),記錄造影峰值強(qiáng)度值(p

14、eakintensity,PI)。為排除人工測量誤差,所有造影影像均由2名超聲科工作人員獨(dú)立進(jìn)行分析,并取其平均值作最終分析。
　　3.3肝創(chuàng)傷后止血效果比較:三組實(shí)驗(yàn)兔肝葉切口治療前均有明顯的出血,10s初始出血率分布在0.10±0.08ml/s-0.12±0.04ml/s,組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。采用不同的處理因素治療后,Sham組和US組治療后切口還有較明顯的滲血和出血,視覺評分分布在2級-4級,而MEUS組切口出

15、血基本止住,持續(xù)觀察數(shù)分鐘無肉眼活動(dòng)性出血,視覺評分分布在0級–1級,顯著低于兩個(gè)對照組(p<0.01)。而包括治療時(shí)2min
　　在內(nèi)的10min出血量在MEUS組為(1.83±1.43)ml,也顯著低于Sham組(11.02±3.56)ml和US組(12.21±5.13)ml(p<0.01),與視覺評分結(jié)果吻合。
　　3.4肝創(chuàng)傷區(qū)病理檢查結(jié)果:MEUS組肝細(xì)胞氣球樣變、渾濁腫脹,肝細(xì)胞體積顯著增大壓迫肝竇,肝竇嚴(yán)重受壓

16、管腔萎縮,有的區(qū)域幾乎消失。肝細(xì)胞排列呈類似腫瘤細(xì)胞的實(shí)體樣,匯管區(qū)門靜脈周圍出現(xiàn)袖套樣片狀充血、出血等。而US組和Sham組肝細(xì)胞仍然顯示了正常的肝細(xì)胞及肝內(nèi)血竇形態(tài),與正常組織病理學(xué)顯示無差異。
　　結(jié)論:
　　1.脈沖式治療超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)通過暫時(shí)性阻斷局部肝實(shí)質(zhì)的血液循環(huán),從而達(dá)到肝創(chuàng)傷止血作用。
　　2.超聲聯(lián)合微泡組止血的病理機(jī)制可能主要是肝細(xì)胞氣球樣變、渾濁腫脹以及匯管區(qū)出血等,從而壓迫了肝竇阻